www.spermova.pe Spermova 2021; 11(1): 67-72 Artículo original - Original paper DOI. 10.18548/aspe/0009.10 EFFECT OF THE USE OF TWO SPERM SELECTION TECHNIQUES FOR IN VITRO PRODUCTION OF ALPACA EMBRYOS Efecto del uso de dos técnicas de selección espermática en la producción in vitro de embriones de alpaca Mijaíl Contreras Huamani1* , Mary Luz Naveros2, Cesar A. Olaguivel3 1 Laboratorio de ABSTRACT Biotecnología Reproductiva. Estación The objective of this research was to evaluate the effect of the use of two sperm selection Experimental Agraria techniques for in vitro production of alpaca embryos. The ovaries and testis were collected from Canaán. Instituto the local slaughterhouse and transport to 37 ° C in saline solution (0.9%) supplemented with Nacional de Innovación gentamicin. Quality I, II and II oocytes were incubated in a maturation medium for 32 h at 38.5 Agraria, Ayacucho, ° C and 5% O2 and 5% CO2. For in vitro fertilization, sperm from the epididymis were selected Perú using the Percoll gradient and Swim up technique. 18h after the oocytes were incubated with the 2 Estación Experimental sperm, these were denuded from the cumulus cells and cultured in SOFaa culture medium for 7 Agraria Santa Ana. days. Morula and blastocyst rate and their morphological quality are evaluated at day 7 of Instituto Nacional de culture. From a total of 370 ovaries, 1,137 oocytes were recovered, making an average of 3.6 Innovación Agraria oocytes / ovary. After the maturation and fertilization process and in vitro culture, the blastocyst (INIA). Carretera Saños rate was 8.43 ± 6.04% and 3.89 ± 1.75%, for oocytes fertilized with sperm selected with Percoll Grande - Hualahoyo gradient and Swim up, respectively, not finding significant statistical differences (p> 0.05), Km 8 Santa Ana El between the groups. In conclusion, the in vitro fertilization of alpaca oocytes with spermatozoa Tambo, Huancayo, selected with two selection techniques (percoll and swim up) did not significantly influence the Junín. quantity and quality of morulae and blastocysts at day 7 of embryo culture. 3 Laboratorio de Fisiología Veterinaria, Keywords: Alpaca, embryo, sperm selection, Percoll, Swim up. Medicina Veterinaria, Universidad Nacional de San Cristóbal de RESUMEN Huamanga, Ayacucho, Perú. El objetivo del presente trabajo de investigación fue evaluar el efecto del uso de dos técnicas de selección espermática en la producción in vitro de embriones de alpaca. Los ovarios y testículo fueron colectados del matadero local, y trasladados a 37°C en solución salina (0.9%) * Corresponding author: suplementado con gentamicina. Los ovocitos de calidad I, II y II fueron incubados en medio de Mijaíl Contreras maduración por 32 h a 38.5 °C y 5% O2 y 5% CO2. Para la fecundación in vitro, los E-mail: espermatozoides del epidídimo fueron seleccionados mediante la técnica de gradiente de Percoll chmijail17@gmail.com y Swim up. 18h después de incubados los ovocitos con los espermatozoides, estos fueron denudados de las células del cumulus y cultivados en medio de cultivo SOFaa durante 7 días. Se evalúa la tasa de mórulas y blastocistos y su calidad morfológica al día 7 de cultivo. De un total Recibido: 07/06/2021 de 370 ovarios se recuperaron 1137 ovocitos, haciendo un promedio de 3,6 ovocitos/ovario. Aceptado: 26/07/2021 Luego del proceso de maduración y fecundación y cultivo de in vitro, la tasa de blastocistos fue de 8,43 ± 6,04% y 3,89 ± 1,75%, para ovocitos fecundados con espermatozoides seleccionados Publicado: 13/08/2021 con gradiente de Percoll y Swim up, respectivamente, no encontrándose diferencias estadísticas significativas (p>0.05), entre los grupos. En conclusión, la fecundación in vitro de ovocitos de alpaca con espermatozoides seleccionadas con dos técnicas de selección (percoll y swim up) no influyen significativamente en la cantidad y calidad de mórulas y blastocistos al día 7 de cultivo embrionario. Palabras claves: Alpaca, embrión, selección espermática, Percoll, Swim up. - 67 - DOI. 10.18548/aspe/0009.10 Contreras M, Naveros M, Olaguivel C. SPERMOVA. 2021; 11(1): 67-72 INTRODUCCION MATERIALES Y MÉTODOS La producción in vitro de embriones (PIVE), representa una Lugar de estudio alternativa productiva para el mejoramiento genético de los El presente trabajo de investigación se desarrolló en el Camélidos Sudamericanos domésticos y silvestres (CSA), esta Laboratorio de Biotecnología Reproductiva Animal de la biotecnología puede contribuir a la multiplicación de animales Estación Experimental Agraria Canaán, Instituto Nacional de de alto valor genético. Debido a ello, se vienen desarrollando Innovación Agraria (INIA), ubicado en el distrito Andrés Avelino diversas estrategias para incrementar la eficiencia de la Cáceres Dorregaray provincia de Huamanga Departamento producción in vitro de embriones. Sin embargo, estas aún los de Ayacucho, Perú, a una altitud de 2735 m.s.n.m. procedimientos para camélidos sudamericanos no están estandarizados (Mamani, 2015). Obtención del material biológico Las ovarios y testículos de alpacas fueron colectadas del La PIVE realizada a partir de ovarios y testículos de matadero matadero Municipal de Pilpichaca, provincia de Huaytará, involucra cuatro procesos fundamentales, maduración in vitro Huancavelica, Perú. Los ovarios fueron transportados en de ovocitos (MIV), selección y capacitación espermática, solución fisiológica (NaCl 0.9%) suplementado con gentamicina fecundación in vitro (FIV) y cultivo in vitro de embriones (CIV); (80 mg/L) en termo aséptico a 37° C, por un tiempo de 4 horas. estas cuatro etapas comprenden diversos procesos fisiológicos y reacciones bioquímicas, condicionando cada uno el éxito o el Recuperación y selección de ovocitos fracaso del siguiente (Santa Cruz et al., 2014; Salgado et al., Los ovarios en el laboratorio se mantuvieron a 37° C en baño 2013). maría (Kossodo, YCW-010E) durante la aspiración folicular. Los folículos de 2 a 7 mm de diámetro fueron aspirados y el La selección de espermática es una parte del proceso que líquido folicular fue depositado en tubo cónico, para que requiere una eficiencia con el fin de garantizar una mayor después de 15 min de sedimentación, obtener el pellet de producción de embriones (Huanca et al., 2014). En camélidos ovocitos + células de cúmulus. sudamericanos se han descrito dos metodologías de selección espermáticas, Swim-up (Huamán et al., 2011; Ayuque et al., La selección de complejo ovocito-cumulus (COCs) se realizó con 2013) y gradiente de densidad Percoll y el Androcoll® ayuda de estereoscopio (Motic, modelo: SMZ-168) a 20 a (Machicado et al., 2009; Berland et al., 2010). Estas dos 40X. Los COCS de calidad I, II y III fueron lavados en medio técnicas son los más comunes para seleccionar espermatozoides de manipulación y luego colocados en grupos (25 COcs/ poza) en diferentes especies, incluidos los humanos. medios de maduración preincubadas en placas de 4 pozas (4 well) con 500 µL, siguiendo las recomendaciones de Ratto et La técnica de Swim-up requiere motilidad progresiva de los al. (2005) (Figura 1B). espermatozoides para su selección. Con esta técnica es posible obtener un alto porcentaje de espermatozoides móviles y morfológicamente normales. Además, es un método de bajo costo, de fácil preparación y no es necesario exponer los espermatozoides a sustancias que puedan ser tóxicas. Aunque, la desventaja es que los eyaculados deben tener espermatozoides de alta concentración y buena motilidad. El método de gradiente de densidad se basa en el uso de centrifugación y los espermatozoides móviles con mayor densidad especifica pueden atravesar diferentes densidades y llegar al fondo del tubo. Su principal ventaja es que se puede Figura 1. A) Sujeción de ovario de alpaca para la aspiración utilizar con eyaculados de baja concentración espermática y folicular con jeringa y B) Placas de 4 pozas conteniendo medio de motilidad reducida. Aunque, la desventaja es el alto costo de maduración de 500 µL por poza. y la dificultad de preparar gradientes de densidad (Santa Cruz et al., 2016). Maduración de ovocitos La estandarización de protocolos de fecundación in vitro en Los COCS fueron incubados (Bionex, VS-9160GC) por 32h en Camélidos Sudamericanos sugiere estudiar diferentes métodos medio de maduración formulado por: TCM-199, piruvato de de selección espermática que garanticen menor daño sodio (0,011 g/mL), 17-β estradiol (22,2 mg/mL), L-glutamina espermático principalmente a nivel de membrana, cromatina y (0,015 g/mL), FSH (0,5 mg/mL), LH (0,5 mg/mL), SFB (5%), ADN nuclear y que posean buena motilidad y concentración gentamicina (40 mg/ml), a una temperatura de 38.5 °C, en del espermática, con el propósito de obtener mayor número de 5% O2 y 5% CO2 y 90% de humedad relativa. embriones divididos después de la fecundación in vitro. La existencia de muy pocos reportes de producción de embriones Recuperación y selección de espermatozoides in vitro a partir de espermatozoides de alpaca refrigerado. El La recuperación de espermatozoides de testículos de presente trabajo tiene como objetivo el efecto del uso de dos matadero se realizó por microcorte de la cola del epidídimo y técnicas de selección espermática en la producción in vitro de resuspendidos con dilutor comercial Andromed® al cual se embriones de alpaca. mantuvo a medio ambiente por 10 minutos y luego, llevados a refrigeración a 5° C durante de 32 horas hasta el momento de la selección de espermatozoides realizado por dos técnicas de 68 DOI. 10.18548/aspe/0009.10 Contreras M, Naveros M, Olaguivel C. SPERMOVA. 2021; 11(1): 67-72 selección espermática (Santayana, 2011) previo a la fecundación in vitro. Selección por gradiente de Percoll. Se preparó una columna de percoll 45/90 en microtubo de 1.5 mL. La formulación de Percoll 90 es a base de Sperm TALP 10X, NaHCO3 Lactato de sodio, MgCl2 6H2O y CaCl2.2H2O. Una muestra espermática diluida (200 µL) se colocó encima de la columna de percoll 45/90. Inmediatamente, se realizó la centrifugación a 700 xg por15 minutos. Se eliminó el sobrenadante, luego se adicionó 200 µL de medio Sperm -TALP, para luego centrifugar a 350 Figura 2. A) Microtubo con medio para selección de xg por 6 minutos. Finalmente se realizó una segunda espermatozoides por Swim up, B) Microtubo con columna de centrifugación a 350 xg por 6 minutos adicionando 100 µL de percoll para la selección de espermatozoides por gradiente medio de capacitación (Sperm -TALP, piruvato de Na, de Percoll y C) Blastocisto protruido de alpaca a los 7 días Albumina Sérica Bovina y gentamicina). El pellet obtenido fue post fecundación. resuspendido con medio Fert-TALP suplementado con 6 mg/mLde BSA sin ácidos grasos y 10 mg/mL de heparina, Análisis estadístico para tener una concentración final de 1,0 x 106 Para la comparación de las variables en el uso de técnicas de espermatozoides/mL, siguiendo los protocolos de Ratto et al. selección de espermatozoides se utilizó la prueba de t de (2007) y Berland et al. (2011). Lo pellets con menos de 50% student. La variable calidad embrionaria fue comparada de de motilidad fueron eliminadas. las dos técnicas de selección con la prueba de Chi cuadrado. Lo análisis de los datos se realizó utilizando el paquete Selección por Swim up. Se preparó en un criovial conteniendo Statistical Analysis Systems (SAS, v9.2). 200 µL de medio Sperm-TALP, al cual se adiciono 200 µL de muestra de espermatozoides y se centrifugó a 350 xg por 6 minutos, se descartó el sobrenadante. El pellet se resuspendió RESULTADOS en 200 ul de medio Sperm-TALP y se volvió a centrifugar a 350 xg por 6 minutos, se eliminó el sobrenadante. El pellets se De un total de 370 ovarios se recuperaron 1137 ovocitos, volvió a resuspender con 50 ul de medio Fert-TALP, con ayuda haciendo un promedio de 3,6 ovocitos/ovario. Los COCs de una micropipeta fueron depositado a la base de un criovial evaluados y utilizados en FIV, estaban distribuidos en 46.08 ± de 1.5 ml que contiene medio FIV, y se llevó a incubación, 8.93, 41.34 ± 18.00 y 12.58 ± 3.58% de categoría I, II y III, colocándose en una posición de 45° de inclinación por 30 respectivamente. minutos y una temperatura de 38.5°C en incubadora (Bionex, VS-9160GC), para que los espermatozoides motiles migren Los espermatozoides recuperados del epidídimo tenian una hacia la superficie. Luego se recolecto 800 μL de la fracción concentración de 92 x 106 espermatozoides/mL y una superior de cada tubo Eppendorf y se colocaron en 2 mL de motilidad de 60%. Sometido a las técnicas de selección Fert-TALP en un tubo cónico de 15 ml y se centrifugaron dos espermática, la concentración (102 x106/ml y 32 x106/ml) y veces a 1500 RPM durante 6 min). El pellet obtenido fue motilidad (70 y 70%) para gradiente de percoll y swim up, resuspendido con medio Fert-TALP suplementado con 6 mg/mL respectivamente. de BSA sin ácidos grasos y 10 mg/mL de heparina, para tener una concentración final de 1,0 x 106 espermatozoides/mL, A 7 días en cultivo, la tasa de blastocistos fue de 8,43 ± 6,04% siguiendo los protocolos de Shamsuddin et al. (2014). y 3,89 ± 1,75%, para ovocitos fecundados con espermatozoides seleccionados con gradiente de Percoll y Fecundación in vitro Swim up, respectivamente, no encontrándose diferencias Los espermatozoides seleccionados por técnica de gradiente estadísticas significativas (p>0.05), entre los grupos. de Percoll y Swim up y los ovocitos fueron incubados y cultivados por un tiempo de 18 h, siguiendo los protocolos Huanca et al. (2014). Tabla 1. Porcentaje de mórulas y blastocistos obtenidos al día 7 de cultivo in vitro con espermatozoides seleccionados con Cultivo in vitro gradiente de percoll y swim up en alpaca (Vicugna pacos). Finalizada las 18h de incubación espermatozoides y ovocito, los ovocitos fueron denudados de las células del cumulus por Percoll Swim up pipeteo. Posteriormente, los presuntos cigotos fueron cultivados Estado de n Media± DE, % n Media± DE, % en medio SOFaa a una atmósfera de 38.5°C, 5% O2 y 5% Desarrollo CO2 y 90% de humedad relativa, por un tiempo de siete días, Ovocitos 499 361 para finalmente ser evaluados según calidad de embriones (Bó a a y Mapletoft, 2018) (Figura 2). Mórulas 64 15.80±6.86 44 11.54±5.79 (D7) Blastocistos 44 8.43±6.04 a 12 3.89±1.75a (D7) Dia 7 108 21.60±13.89a 56 14.79±7.04a (mórulas + blastocistos) a-bLetras diferentes entre columnas representan diferencias significativas (p<0,05). 69 DOI. 10.18548/aspe/0009.10 Contreras M, Naveros M, Olaguivel C. SPERMOVA. 2021; 11(1): 67-72 El análisis estadístico de la calidad morfológica de las mórulas morfológicamente normales con una alta motilidad progresiva y blastocistos producidos in vitro al día 7 en cultivo, muestra que puede desempeñar un papel importante en la producción que no existe diferencia estadística (p>0.05) en los dos grupos de embriones in vitro. Para Mendoza et al. (2008) la técnica a la prueba de Chi cuadrado (ver tabla 2 y 3). de selección espermatica “swim-up” presenta varias ventajas, reduce el tiempo y el número de centrifugaciones y minimiza el daño a los espermatozoides. Tabla 2. Calidad de mórulas, según técnica de selección espermática en alpacas. CONCLUSION Percoll Swim up Categoría n % n % La fecundación in vitro de ovocitos de alpaca con Excelente 14 21.88 12 27.27 espermatozoides seleccionadas con dos técnicas de selección Buena 33 51.56 25 56.82 (percoll y swim up) no influyen significativamente en la Regular 13 20.31 4 9.09 cantidad y calidad de mórulas y blastocistos al día 7 de cultivo Malo 4 6.25 3 6.82 embrionario. Tabla 3. Calidad de blastocistos, según técnica de selección Agradecimientos es permática. Al Programa de Investigación en Camélidos Sudamericanos del Percoll Swim up del Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA) por los Categoría n % n % insumos y materiales y equipos brindados. Al MVZ. Rubén Excelente 17 38.64 3 25.00 Herberht Mamani Cato por el apoyo en el análisis estadístico. Buena 16 36.36 8 66.67 Regular 8 18.18 1 8.33 Contribuciones de autores Malo 3 6.82 0 0.00 Preparación y ejecución: (Mijail Contreras), Desarrollo de la metodología: (Mijail Contreras, Mariluz Naveros) Concepción y diseño: (Mijail Contreras, Mariluz Naveros, César Olaguivel) DISCUSIONES Edición del artículo (Mijail Contreras, Mariluz Naveros, César Olaguivel) Supervisión del estudio: (Mijail Contreras,César En el presente trabajo de investigación, la tasa de blastocistos Olaguivel) fue de 8,43 ± 6,04% y 3,89 ± 1,75%, para ovocitos fecundados con espermatozoides seleccionados con gradiente Conflictos de intereses de Percoll y Swim up, respectivamente(p>0.05). Resultados Los autores firmantes del presente trabajo de investigación similares reporta Ruiz et al. (2017), utilizando espermatozoides declaran no tener ningún potencial conflicto de interés personal de dos técnicas de selección de espermatozoides (Swim-up y o económico con otras personas u organizaciones que puedan gradiente de Percoll) no encontraron influencia en la tasa de influir indebidamente con el presente manuscrito. blastocistos. Además, Mamani (2015) evaluando dos métodos de selección espermática (swim-up y washing) no encontraron efecto en la tasa de fecundación (35.17 y 36.82%), REFERENCIAS respectivamente. Nuestros resultados son superiores a los reportados por Gamarra et al. (2008), quienes reportaron 8% 1. Ayuque A, A., y Justiniano H, E. C. Evaluación de diferentes de mórulas e inferiores a 86% de mórulas reportados por tiempos para la maduración nuclear de ovocitos de llama Huamán et al. (2011). (lama glama) en el desarrollo de embriones producidos por fecundación in vitro; 2013. Santa Cruz et al. (2016) al comparar las dos técnicas de http://repositorio.unh.edu.pe/handle/UNH/752 selección (Androcoll, Percoll y Swim-up) obtuvo una mejor 2. Berland MA, Von Baer A, Ruiz J, Parraguez VH, Morales P, motilidad progresiva y funcionalidad de membrana con ambos Adams GP, et al. In vitro fertilization and development of coloides, en comparación con Swim-up. Asimismo, Conde et al. cumulus oocytes complexes collected by ultrasound-guided (2008), Morrell et al. (2009), Ruiz et al. (2010) y Trasorras et follicle aspiration in superstimulated llamas. al. (2017) observaron un aumento de la motilidad progresiva Theriogenology. 2011;75(8):1482-8. en muestras seleccionadas con Androcoll y percoll https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2010.11.047 3. Berland MO, von Baer A, Ruiz J, Parraguez V, Morales P, La mayoría de los estudios de fecundación in vitro realizados Adams GP, Ratto MH. In vitro fertilization and development en llamas y alpacas se han realizado utilizando of cumulus oocyte complexes collected by ultrasound- espermatozoides epididimarios y procesados por gradientes guided follicular aspiration in superstimulated llamas. de Percoll 45/90 o Androcoll (Del Campo et al., 1994; Ratto Theriogenology 2011; 75: 1482-1488. et al., 2007; Berland et al., 2011; Trasorras et al., 2012). En https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2010.11.047 este estudio, el método de selección de espermatozoides de 4. Bó GA, Mapletoft RJ. Evaluation and classification of alpaca no afectó la tasa de desarrollo a blastocistos. Siendo bovine embryos. Anim Reprod AR. 2018; 10(3):344-8. similar a los resultados reportados en bovinos por Parrish et al. (1995) y Seidel et al. (1995) 5. Conde PA, Herrera C, Trasorras VL, Giuliano SM, Director A, Miragaya MH, et al. In vitro production of llama (Lama El método de selección de espermatozoides, Swim-up y Percoll, glama) embryos by IVF and ICSI with fresh semen. Anim proporcionan poblaciones de espermatozoides 70 DOI. 10.18548/aspe/0009.10 Contreras M, Naveros M, Olaguivel C. SPERMOVA. 2021; 11(1): 67-72 Reprod Sci. 2008;109(1-4):298-308. development. Theriogenology. 1995;44(6):859-69. https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2007.10.004 https://doi.org/10.1016/0093-691X(95)00271-9 6. Condori RL, Huanca W, Chileno M, Cainzo J, Valverde F, 18. Ratto M, Berland M, Huanca W, Singh J, Adams GP. In vitro Becerra JJ, et al. 252 effect of follicle-stimulating hormone and in vivo maturation of llama oocytes. Theriogenology. addition on in vitro maturation and cleavage of alpaca 2005; 63(9):2445-57. (vicugna pacos) embryos. Reprod Fertil Dev. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2004.09.053 2010;23(1):224-224. 19. Ratto M, Gomez C, Berland M, Adams GP. Effect of Https://doi.org/10.1071/RDv23n1Ab252 ovarian superstimulation on COC collection and maturation 7. Del Campo MR, Del Campo CH, Donoso MX, Berland M, in alpacas. Anim Reprod Sci. 2007;97(3-4):246-56. Mapletoft RJ. In vitro fertilization and development of https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2006.02.002 llama (Lama glama) oocytes using epididymal 20. Ratto MH, Gomez C, Berland MO, Adams GP. Effect of spermatozoa and oviductal cell co-culture. Theriogenology. ovarian superstimulation on COC collection and maturation 1994;41(6):1219-29. https://doi.org/10.1016/0093- in alpacas. Anim Reprod Sci 2007; 97: 246-256 691X(94)90479-3 https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2006.02.002 8. Gamarra G, Huaman E, León S, Carpio M, Alvarado E, 21. Rho GJ, Hahnel AC, Betteridge KJ. Comparisons of oocyte Asparrin M, et al. 157 First in vitro embryo production in maturation times and of three methods of sperm alpacas (Lama pacos). Reprod Fertil Dev. 2008;21(1):177- preparation for their effects on the production of goat 8. https://doi.org/10.1071/RDv21n1Ab157 embryos in vitro. Theriogenology. 2001;56(3):503-16. 9. Huamán E, Ticllacuri F, Landeo L, Ruiz J. Efecto de la https://doi.org/10.1016/S0093-691X(01)00581-7 atmósfera de cultivo sobre el desarrollo de embriones de 22. Ruiz J, Santayana RP, Mendoza MJ, Landeo JL, Huamán E, alpacas producidos por fecundación in vitro. XXXIV Ticllacuri F, et al. Effect of oocyte maturation time, sperm Reunión Científica Anu Asoc Peru Prod Anim. 201 selection method and oxygen tension on in vitro embryo 10. Huanca W, Condori R, Cainzos J, Chileno M, Quintela L, development in alpacas. Theriogenology. 2017;95:127- Becerra J, et al. 341 in vitro maturation and in vitro 32. fertilization of alpaca (vicugna pacos) oocytes: effect of https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2017.03.006 time of incubation on nuclear maturation and cleavage. 23. Ruiz J., Correa J. y Martínez M. Vitrificación de ovocitos Reprod Fertil Dev. 2009;22 (1):327-327. bovinos y su uso en el desarrollo partenogenético de https://doi.org/10.1071/RDv22n1Ab341 embriones. Arch Med Vet; 2010; 42: 79-83. 11. Huanca W, Condori R, Chileno M, García P, Cainzo J y http://dx.doi.org/10.4067/S0301- Becerra J. Evaluación de cuatro tiempos de cultivo sobre la 732X2010000100011 tasa de maduración y división posfecundación in vitro de 24. Salgado R, Simanca J y Vergara O. Efecto del factor de ovocitos de alpaca. Rev Inv Vet Perú. 2014;25(4):468-76. crecimiento epidermal (EGF) sobre la maduración de http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v25i4.10782 ovocitos bovinos cultivados in vitro. Revista científica, FCV- 12. Huanca W, Condori RL, Chileno MA, Cainzos J, Becerra JJ, LUZ. 2013;23(4):325-8. 7. Quintela LA, et al. 211 in vivo maturation and in vitro 25. Samardzija M, Karadjole M, Getz I, Makek Z, Cergolj M, fertilization of alpaca oocytes. Reprod Fertil Dev. 2010;23 Dobranic T. Effects of bovine spermatozoa preparation on (1):204-5. https://doi.org/10.1071/RDv23n1Ab211 embryonic development in vitro. Reprod Biol Endocrinol. 13. Machicado, R.; Delgado, P. y Flores, M. Descripción del 2006;4(1):1-7. proceso de fertilización in vitro de ovocitos de llama (lama 26. Santa Cruz C, Huanca W, Condori R y Ampuero A. Uso de glama) obtenidos por súper estimulación ovárica con eCG macromoléculas sobre la tasa de maduración y desarrollo y fertilizados con semen tratado con proteasa. V Congreso embrionario in vitro de ovocitos bovinos. Rev Inv Vet Perú. Mundial sobre Camélidos. Riobamba, Ecuador. 2009. 2014;25(4):487-93. 6. 14. Mamani MGD. Métodos de selección espermática y tasa http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v25i4.10799 de fecundación in vitro en ovocitos de alpaca (Vicugna 27. Santa Cruz R, Giuliano SM, Gambarotta MC, Morrell JM, pacos). 2015. Abraham MC, Miragaya MH, et al. Comparison of http://repositorio.lamolina.edu.pe/handle/UNALM/1830 differents methods of sperm selection of llama raw semen. 15. Mendoza J, Ayuque A, Trivinio F, Ayuque G, Landeo L, Ruiz Anim Reprod Sci. 2016;173:8-12. J. Evaluación de dos métodos de recuperación de https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2016.08.001 espermatozoides epididimarios para la fecundación in 28. Santayana P. Tiempo de maduración de ovocitos Vicugna vitro de ovocitos de alpacas. XXXI Reunión científica de la pacos «alpaca» en el desarrollo embrionario por Asociación Peruana de 434 Producción Animal. Lima. Perú. fecundación in vitro. Ayacucho-Perú [[Tesis Pregrado]]. 2008; pp.54. [Huancavelica]: Universidad Nacional de San Cristóbal de 16. Morrell JM, Dalin AM, Rodriguez-Martinez H. Comparison Huamanga. Facultad de Ciencias Biológicas; of density gradient and single layer centrifugation of 2011.//doi.org/10.1016/j.theriogenology.2004.09.053 stallion spermatozoa: yield, motility and survival. Equine 29. Seidel GE, Leipold SD, Shawki H. Preparation of bovine Vet J. enero de 2009;41(1):53-8. sperm for in vitro fertilization by swim-up or centrifugation https://doi.org/10.2746/042516408X322139 through Percoll or BSA. Theriogenology. 1995;1(43):319. 17. Parrish JJ, Krogenaes A, Susko-Parrish JL. Effect of bovine 30. Shamsuddin M, Rodriguez-Martinez H, Larsson B. Fertilizing sperm separation by either swim-up or Percoll method on capacity of bovine spermatozoa selected after swim-up in success of in vitro fertilization and early embryonic 71 DOI. 10.18548/aspe/0009.10 Contreras M, Naveros M, Olaguivel C. SPERMOVA. 2021; 11(1): 67-72 hyaluronic acid-containing medium. Reprod Fertil Dev 1993; 5: 307–315. 31. Trasorras V, Giuliano S, Chaves G, Neild D, Agüero A, Carretero M, et al. In vitro Embryo Production in Llamas (Lama glama) from In vivo Matured Oocytes with Raw Semen Processed with Androcoll-E using Defined Embryo Culture Media. Reprod Domest Anim. 2012;47(4):562-7. https://doi.org/10.1111/j.1439-0531.2011.01917.x 32. Trasorras, VL, Carretero, MI, Neild, DM, Chaves, MG, Giuliano, SM y Miragaya, MH. Producción, conservación y transferencia de embriones de camélidos sudamericanos. Fronteras en la ciencia veterinaria, 2017; 4, 190. https://doi.org/10.3389/fvets.2017.00190 72