© Universidad Científica del Perú Ciencia amazónica (Iquitos) 2013, Vol. 3, No. 2, 60-66 ISSN 2222-7431 (En línea) http://revistas.ojs.es/index.php/cienciaamazonica Artículo Original Fluctuación diurna del contenido de vitamina C en hojas de Myrciaria dubia “camu camu” [Diurnal fluctuation of vitamin C in leaves of Myrciaria dubia “camu camu”] Franz M. Correa-Meléndez1*, Marianela Cobos-Ruiz1, Roberson Ramirez-Saavedra2, Sixto A. Imán-Correa3 & Juan C. Castro-Gómez2 1Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Científica del Perú, Av. Abelardo Quiñones Km 2.5, Iquitos, Perú. 2Centro de Investigación de Recursos Naturales (CIRNA). Universidad Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP). Pasaje Los Paujiles S/N, AAHH Nuevo San Lorenzo. Iquitos-Perú. 3Instituto Nacional de Innovación Agraria-Estación Experimental San Roque. *e-mail: franzmich07@hotmail.com Resumen Myrciaria dubia “camu camu” es un frutal del trópico amazónico caracterizado por sus frutos con gran contenido de vitamina C, siendo considerado un producto importante del país. Sin embargo, hay pocos reportes sobre el metabolismo y transporte de vitamina C en esta especie. El objetivo de la investigación fue determinar la fluctuación diurna del contenido de vitamina C en hojas de M. dubia “camu camu”. Las hojas se colectaron de la colección de germoplasma de “camu camu” del INIA a las 2, 6, 10, 14, 18 y 22 horas; de cuatro plantas y en tres fechas diferentes. La vitamina C fue extraída de las hojas con un método estandarizado en el laboratorio y se cuantificó mediante espectrofotometría a 530nm, previa reacción con 2,6-diclorofenolindofenol. Los resultados muestran que el contenido de vitamina C de las hojas de “camu camu” fue en promedio 231±35 mg vitamina C/100g de hoja. Además, el contenido de vitamina C en las hojas del “camu camu” mostró fluctuación diurna, siendo menor a las 6 horas y mayor a las 2 y 14 horas del día. También, se registraron concentraciones intermedias en horas de menor o ausencia de radiación solar (235±17 y 237±35 mg vitamina C/100g de hoja a las 18 y 22 horas respectivamente). Se concluye que existe alto contenido de vitamina C en las hojas del “camu camu” y que este contenido presenta fluctuación diurna. Palabras clave: Myrciaria dubia, camu camu, vitamina C, fluctuación diurna, hojas. Abstract Myrciaria dubia "camu camu" is a fruit of Amazonian tropics characterized by high content of vitamin C, being considered a important product of the country. However, there are few reports on the metabolism and transport of vitamin C in this species. The research objective was to determine the diurnal fluctuation of vitamin C in leaves of M. dubia "camu camu". Leaves were collected from the germplasm collection of "camu camu" from INIA at 2, 6, 10, 14, 18 and 22 hours, from four plants and three different dates. Vitamin C was extracted from leaves with a standardized method in the laboratory and quantified by spectrophotometry at 530nm, after reaction with 2,6-dichlorophenolindophenol. Results show that vitamin C content of leaves of "camu camu" averaged 231±35 mg vitamin C/100g of leaves. In addition, vitamin C content in the leaves of "camu camu" showed diurnal fluctuation, being lower at 6 h and increased at 2 and 14 hours of day. Also, were recorded intermediate concentrations in hours with lower or absence of solar radiation (235±17 and 237±35 mg vitamin C/100g of leaves at 18 and 22 hours respectively). In conclusion, there is a high vitamin C content in leaves of "camu camu" and this content has diurnal fluctuation. Keywords: Myrciaria dubia, camu camu, vitamin C, diurnal fluctuation, leaves. Recibido: 20 Julio 2012 Aceptado: 05 Mayo 2013 Este artículo puede ser citado como: FM Correa-Meléndez, M Cobos-Ruiz, R Ramírez-Saavedra, SA Imán-Correa & JC Castro- Gómez. 2013. Fluctuación diurna del contenido de vitamina C en hojas de Myrciaria dubia “camu camu”. Cienc amaz (Iquitos) 3(2), 60-66. 60 Correa-Meléndez et al. Fluctuación diurna de vitamina C en Myrciaria dubia INTRODUCCIÓN metabolito es canalizado a la ruta de La Amazonía es el mayor bosque tropical que Smirnoff-Wheeler, en la que la GDP-manosa- existe en el mundo, abarca aproximadamente 1-fosfato es convertida a ácido ascórbico. En 6 059000 km2 y contiene más del 50% de las este proceso enzimático se forman especies registradas hasta el momento (Uhl y intermediarios metabólicos como GDP- Dransfield, 1997). Con el actual desarrollo de Manosa, GDP-L-Galactosa, L-Galactosa-1- fuentes económicas a través de la explotación fosfato, L-Galactosa y L-galactona-1,4-lactona. de nuestros recursos naturales, es necesario Varios estudios han determinado el contenido el estudio en todas las formas de aquellos que de vitamina C en los frutos del “camu camu” representen una mayor importancia para el (Peters y Vasques, 1988; Vizcarra, 2005). Sin desarrollo social y económico de la población, embargo, no existen reportes de la y uno de ellos es Myrciaria dubia también determinación del contenido de esta vitamina conocido como “camu camu”. Este producto, en las hojas, uno de los principales órganos es valorado a nivel mundial debido de fotosíntesis y por ende de biosíntesis de principalmente a las altas concentraciones de vitamina C. Además, se desconoce su relación ácido ascórbico (vitamina C), siendo con los factores físicoquímicos (temperatura, denominado por el Perú como producto horas del día e intensidad de luz, factores bandera a nivel Nacional para que sea nutricionales entre otros). Por tanto, el impulsor del crecimiento económico del país. objetivo de esta investigación fue determinar la fluctuación diurna del contenido de vitamina Myrciaria dubia (Kunth) Mc Vaugh, de la C en hojas de M. dubia “camu camu”. familia Myrtacea es un arbusto que crece comúnmente en la orilla de las quebradas y MATERIALES Y MÉTODOS cochas de la cuenca amazónica. La especie Colecta de material botánico forma una parte importante de la vegetación Las muestras biológicas fueron obtenidas de riparia en Perú, Brasil, Venezuela y Colombia, la colección de germoplasma de “camu camu”, pero se presenta en mayor abundancia en la de la estación experimental “El Dorado” del Amazonía Peruana, donde se encuentran Instituto Nacional de Innovación Agraria poblaciones naturales extensas (Peters y (INIA), ubicado a la altura del km 25½ de la Vásquez, 1988). carretera Iquitos-Nauta (3°57'22.95''LS, El ácido ascórbico, también conocido como 73°24'46.91''LO). vitamina C, es producido sintéticamente y Se eligieron al azar cuatro plantas de la extensivamente usado en la industria de colección de germoplasma de “camu camu” alimentos por su acción antioxidante (códigos de accesión: 7,2, 52,9, 53,3 y 56,2). (Chambers et al., 1996). En muchos alimentos Las hojas adultas en buen estado, fueron es adicionado como suplemento (jugos de colectadas cada cuatro horas (2, 6, 10, 14, 18 fruta, por ejemplo), siendo usado en la y 22 horas del día) por triplicado y en tres medicina como pastillas multivitamínicas. El fechas diferentes (31/08/11, 05/10/11 y ácido ascórbico es un agente reductor en 05/11/11). Las muestras obtenidas fueron solución acuosa. El carácter ácido y la acción transportadas en condiciones de refrigeración reductora son atribuidos al grupo enediol al Laboratorio de Biotecnología del Centro de (David et al., 1994). Investigación de Recursos Naturales (CIRNA) La principal ruta biosíntetica de vitamina C en de la Universidad Nacional de la Amazonía plantas ha sido recientemente estudiada por Peruana, donde se procesaron Wheeleret al. (1998) y han sido descritas vías inmediatamente para extraer y cuantificar la alternativas (Hancock y Viola, 2005). Castro et vitamina C. al. (2011), ha demostrado la expresión genética y actividad de enzimas de la vía Smirnoff-Wheeler en las hojas y frutos (pulpa y cáscara) del “camu camu”. Este proceso metabólico se inicia con la fotosíntesis, donde la planta toma la luz solar y la transforma en energía química (ATP), para la síntesis de glucosa. Una parte de la glucosa sintetizada es convertida a glucosa-6-fosfato y este Ciencia amazónica (Iquitos) 61 Correa-Meléndez et al. Fluctuación diurna de vitamina C en Myrciaria dubia 8% y EDTA 0,36%). El proceso de extracción se realizó en un ambiente con luz tenue y atemperada a 18 ° C. El triturado se transfirió 3°57'22.95''LS, 73°24'46.91''LO a microtubos de 1,5 ml, se homogenizó en vortex por 30 seg, y centrifugó a 15000 rpm por 10 min a 4°C, el sobrenadante obtenido se transfirió a otro microtubo y almacenó a - Km 25½ 20°C protegido de la luz (figura 2). Cuantificación de vitamina C Carretera Iquitos-Nauta Se efectuó en base a Loeffler y Pointing (1942) modificado, que consistió en mezclar 100 µl del sobrenadante obtenido con 900 µl Figura 1. Ubicación de la Colección de de 2,6-Diclorofenolindofenol 0.5mM, se Germoplasma de “camu camu” del INIA. Lugar homogenizó por 30 seg en el vortex y donde se colectaron las hojas del “camu camu” para extraer y cuantificar la vitamina C. Imagen procedió a leer la absorbancia a 530 nm en un tomada y modificada de Google Earth. espectrofotómetro UV/Vis Genesys 6.0. El blanco de lectura empleado fue ácido oxálico Extracción de vitamina C al 0,4%. La cuantificación de la vitamina C se Se realizó de acuerdo a Ledezma-Gairaud realizó en base a las ecuaciones de dos curvas (1993) modificado. Para ello, 250mg de hoja estándares, una preparada en el rango de 100 se trituró por tres minutos con un mortero, a 200mg/L y la otra en el rango de 200 a añadiendo gradualmente hasta 950 µl de 800mg/L (figura 3). solución extractora (HPO3 3%, ácido acético Pesado de hojas Trituración Homogenización Centrifugación Almacenamiento Figura 2. Proceso de extracción de vitamina C a partir de hojas de Myrciaria dubia “camu camu” 3 2.5 y = -0.004x + 3.536 R² = 0.992 2 1.5 1 0.5 0 200 300 400 500 600 700 800 Vitamina C (mg/L) Figura 3. Curva estándar obtenida al hacer reaccionar 100µl de diferentes concentraciones de vitamina C comercial (200 a 800mg/L) con 900µl de 2,6-diclorofenolindofenol 0,5mM. La absorbancia de cada estándar se leyó a 530nm. Ciencia amazónica (Iquitos) 62 Absorbancia a 530nm Correa-Meléndez et al. Fluctuación diurna de vitamina C en Myrciaria dubia Análisis de datos El contenido de vitamina C en las hojas del Los datos de absorbancia y concentración de “camu camu” mostró fluctuación diurna vitamina C fueron almacenados en una hoja (figura 4). Se observa que el contenido más Excel de Microsoft 2007. Se determinó el bajo de vitamina C se registró a las 6 horas promedio, desviación estándar la prueba de (197±31 mg vitamina C/100g de hoja), ANOVA de un factor y la prueba HSD de momento en que la radiación solar es tenue. Tukey para determinar si los promedios de En contraste, los contenidos más altos de concentración de vitamina C entre hojas vitamina C se registraron a las 2 (240±56 mg colectadas en las diferentes horas del día Vitamina C/100g de hoja) y 14 horas (244±24 mostraron diferencias estadísticas mg Vitamina C/100g de hoja) del día. Por otra significativas. Los análisis estadísticos se parte, concentraciones intermedias de hicieron con el programa PASW Statistics v vitamina C (con respecto a las indicadas) se 18.0 registraron en horas de menor radiación solar (235±17 mg vitamina C/100g de hoja a las 18 RESULTADOS horas) o ausencia de radiación solar (237±35 El contenido de vitamina C en las hojas del mg vitamina C/100g de hojas a las 22 horas). “camu camu” es elevado. Los valores El ANOVA muestra que las fluctuaciones en el fluctuaron de 158 a 298 mg vitamina C/100g contenido de vitamina C en función a las de hoja, con un valor promedio de 231±35 horas del día no mostró diferencias mg vitamina C/100g de hoja. estadísticas significativas (F=0,97, P=0,47). Horas del día Figura 04. Fluctuación diurna del contenido de Vitamina C en hojas de Myrciaria dubia “camu camu”. Ciencia amazónica (Iquitos) 63 mg Vitamina C/100g hojas Correa-Meléndez et al. Fluctuación diurna de vitamina C en Myrciaria dubia DISCUSIÓN la plastoquinona, y que los cambios en los El “camu camu” es una planta muy importante niveles de vitamina C debidos a la luz podría en la región Loreto, debido a que produce estar controlado predominantemente por la frutos con alta concentración de vitamina C misma fotosíntesis, pero no por el aumento de (más de 2000mg de vitamina C/100g de la expresión de genes responsables de la pulpa) y diversos metabolitos secundarios con biosíntesis de vitamina C. potencial uso farmacológico, como El aumento en los niveles de vitamina C en las antocianinas, flavonoides y compuestos horas de mayor intensidad lumínica (14 fenólicos (Sotero et al., 2009). Los frutos son horas), puede deberse a que tiene un rol empleados para la preparación de refrescos, protector durante la fotosíntesis, al evitar los helados y otros productos para el consumo efectos deletéreos de los radicales libres de local, regional y nacional. Además, la pulpa es oxígeno (ROS), que son generados como exportada a diversos países como el Japón subproductos durante la fotosíntesis y como para su procesamiento y consumo. También, un componente clave en los mecanismos de las hojas son empleadas en la medicina disipación de exceso de energía fotónica, tales tradicional para prevenir el escorbuto, aliviar como los ciclos agua-agua (Asada, 1999) y el problemas inflamatorios, prevenir el resfriado ciclo de xantofilas Muller-Moule et al., 2002). común, entre otros usos. Los ROS pueden oxidar diversos componentes Los resultados muestran que también las celulares (proteínas, ADN, ARN, membranas hojas del “camu camu” tienen alto contenido etc.). Para evitar el daño a estas de vitamina C. De tal modo, que presenta de macromoléculas, la planta debe genera más 1,8 a 466 veces más vitamina C que frutos vitamina C y en menor cantidad otras amazónicos como Anacardium occidentale moléculas antioxidantes (α-tocoferol, (127±60 mg vitamina C/100g de pulpa) y carotenoides, flavonoides, etc), para Solanum sessiliflorum (0.50±0.08 mg vitamina neutralizar la acción bioquímica de los ROS C/100g de pulpa) respectivamente (Siguas et (Davey et al., 2000). al., 2010). La oxidación del ascorbato y su regeneración También nuestros hallazgos indican una a partir de monodehidroascorbato (MDHA) y fluctuación diurna en el contenido de vitamina dehidroascorbato (DHA) son mediadas por C en las hojas del “camu camu”. Está bien varios sistemas enzimáticos y no enzimáticos establecido que los niveles de vitamina C en localizados en diferentes estructuras de las las hojas dependen de las condiciones de luz y células vegetales. El ascorbato neutraliza el oscuridad, de tal modo que las hojas efecto oxidante del peróxido de hidrógeno en expuestas a la luz contienen más vitamina C una reacción catalizada por la ascorbato que las hojas mantenidas en oscuridad (Grace peroxidasa. Las isoformas de esta enzima se y Logan, 1996; Smirnoff y Palanca, 1996; localizan en el citosol, cloroplastos, Tabata et al., 2002; Yabuta et al., 2007). mitocondrias, peroxisomas/glioxisomas y Asimismo, los niveles de vitamina C en las están unidos a las membranas de estos hojas muestran un ritmo diurno (Dutilleul et últimos organelos y de los tilacoides. La al., 2003; Tamaoki et al., 2003). Según vitamina E (α-tocoferol) es un antioxidante Yabuta et al. (2007), esto es atribuible a que unido a las membranas celulares que se la regulación de la biosíntesis de vitamina C encarga de neutralizar radicales lipídicos. El por la luz en hojas de Arabidopsis thaliana, es producto radical α-cromanoxilo, es reducido a dependiente de la cadena transportadora de α-tocoferol por el ascorbato. El ascorbato electrones fotosintética y paralelamente existe también es oxidado cuando actúa como un incremento en la expresión de genes cofactor de varias enzimas (prolil hidroxilasas, codantes de enzimas implicadas en la antocianidina sintasa, flavona-3-hidroxilasa, biosíntesis de vitamina C, tales como GDP- alcaloide oxigenasa, giberelina-20-oxidasa, manosa pirofosforilasa, GDP-L-galactosa entre otras). Dos moléculas de MDHA, el guaniltransferasa, L-galactosa-1-fosfato producto de oxidación primario del ascorbato, fosfatasa y Galatono-1,4-lactono pueden generar una de DHA y otra de deshidrogenasa. El incremento en los niveles ascorbato. El MDHA es reducido a ascorbato de expresión de estos genes son afectados por la MDHA reductasa dependiente de principalmente por el estado redox del pool de NAD(P)H o por ferrodoxina reducida en el Ciencia amazónica (Iquitos) 64 Correa-Meléndez et al. Fluctuación diurna de vitamina C en Myrciaria dubia fotosistema I. Finalmente, DHA es reducido a presentado en la Semana de la Ciencia y ascorbato por DHA reductasa dependiente de Tecnología 18-22 Nov. CONCYTEC. glutatión (GSH). El GSH oxidado (GSSG) es Chambers S, Lambert N, Plumb G, Willianson reducido a GSH por glutatión reductasa G. 1996. Evaluation of the antioxidant dependiente de NADPH. Las dos reacciones properties of a methanolic extract from enzimáticas son componentes del ciclo juice plus fruit and juice plus vegetable ascorbato-glutatión. Las enzimas están (dietary supplements). Food Chem 57, ubicadas en el citosol, cloroplasto, estroma, 271-274. matriz mitocondrial y en los Davey M, Van Montagu M, Inze D, San Martin peroxisomas/glioxisomas (Smirnoff, 2000; M, Kanellis A, Smirnoff N et al. 2000. Smirnoff y Wheeler, 2000). Plant L-ascorbic acid: chemistry, function, metabolism, bioavailability and effects of processing. Journal of the Science of Food CONCLUSIONES and Agriculture 80, 825-860. El contenido de vitamina C en las hojas de Myrciaria dubia “camu camu” es relativamente Davis M, Austin J, Partridge D. 1994. Vitamin alto, superando incluso al contenido de esta C: its chemistry and biochemistry. vitamina en la pulpa de varios frutos nativos Cambridge: Royal Society of Chemistry amazónicos. 47, 154-168. El contenido de vitamina C en las hojas de Dutilleul C, Garmier M, Noctor G, Mathieu C, Myrciaria dubia “camu camu” muestra Chetrit P, Foyer CH, De Paepe R. 2003. fluctuación diurna, siendo mayor en horas de Leaf mitochondria modúlate whole cell mayor intensidad luminosa y menor en las redox homeostasis, set antioxidant horas de baja intensidad luminosa. Aunque capacity, and determine stress resistance estas tendencias no fueron estadísticamente through altered signaling and diurnal significativas. regulation. The Plant Cell 15, 1212–1226. Grace SC, Logan BA. 1996. Acclimation of AGRADECIMIENTO foliar antioxidant systems to growth Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología irradiance in three broad-leaved (CONCYTEC) por el apoyo financiero para la evergreen species. Plant Physiology 112, ejecución de esta investigación. Al Centro de 1631–1640. Investigación de Recursos Naturales de la Hancock R y Viola R. 2005. Biosynthesis and Universidad Nacional de la Amazonía Peruana catabolism of L-ascorbic acid in plants. (CIRNA-UNAP) por el soporte con sus Crit Rev Plant Sci 24, 167–188. instalaciones y equipos. Un agradecimiento especial a cada uno de los integrantes del Ledezma-Gairaud M. 2004. Validación del equipo de trabajo del la Unidad Especializada método: determinación de vitamina C de Biotecnología del CIRNA, por el apoyo total por cromatografía líquida de alta constante en las diversas actividades resolución “HPLC”. Tecnología en Marcha. realizadas. 17 (4), 15-23. Loeffler HJ y Pointing JD. 1942. Ascorbic acid: REFERENCIAS rapid determination in fresh, frozen or Asada K. 1999. The water–water cycle in dehydrated fruits and vegetables. Ind Eng chloroplasts: scavenging of active oxygen Chem Anal 14, 846-856. and dissipation of excess photons. Annual Muller-Moule P, Conklin PL, Niyogi KK. 2002. 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Libro de resúmenes UNAMAZ. dependent on the photosynthetic electron Encuentro de Universidades y Centros de transport chain but independent of sugars Investigación. Iquitos-Perú. in Arabidopsis. Journal of Experimental Smirnoff N, Pallanca JE. 1996. Ascorbate Botany 58(10), 2661-2671. metabolism in relation to oxidative stress. Biochemical Society Transactions 24, 472–478. Smirnoff N. 2000. Ascorbic acid: Metabolism and functions of a multi-facetted molecule. Current opinion of Plant Biology 3,229-235. Smironoff N y Wheeler G. 2000. Ascorbic Acid in Plants: Biosynthesis and Function. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 35(4), 291-314. Sotero V, Silva D, García D, Imán S. 2009. Evaluación de la actividad antioxidante de la pulpa, cáscara y semilla del fruto del camucamu (Myrciaria dubia H.B.K.) Rev Soc Quím Perú 75(3), 293-299. Tabata K, Takaoka T, Esaka M. 2002. Gene expression of ascorbic acid-related enzymes in tobacco. Phytochemistry 61, 631–635. 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