DOI: https://doi.org/10.52973/rcfcv-e32112 Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXXII, rcfcv-e32112, 1 - 10 Caracterización bioquímica y filogrupos de Escherichia coli aislados de heces de terneros con diarrea en la Región Cajamarca, Perú Biochemical characterization and Phylogroups of Escherichia coli isolated from feces of calves with diarrhea in the Cajamarca Region, Peru Marco Cabrera-González1* , Sámy Káterin Chávez-Díaz1 , Rodolfo Gustavo Gamarra-Ramírez2 , Héctor Vladimir Vásquez3 , Carlos Quilcate-Pairazamán3 y Medali Cueva-Rodríguez1 1Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA), Dirección de Desarrollo Tecnológico Agrario, Estación Experimental Baños del Inca. Baños del Inca, Cajamarca, Perú. 2Universidad Nacional de Cajamarca, Facultad de Ciencias Veterinarias, Laboratorio de Microbiología Veterinaria. Cajamarca, Cajamarca, Perú, 3Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA), Dirección de Desarrollo Tecnológico Agrario. La Molina, Lima, Perú. *Correo electrónico: mcabrera9@gmail.com RESUMEN ABSTRACT Esta investigación tuvo por objetivo la caracterización bioquímica y la The objective of this research was the biochemical characterization identificación de filogrupos en cepas de Escherichia coli, de heces de and the identification of phylogroups in Escherichia coli strains, from terneros con diarrea, mediante el método de Clermont. Se recogieron feces of calves with diarrhea, using the Clermont method. Thirty-two treinta y dos muestras de ocho rebaños del caserío Tartar Grande, samples were collected from eight herds from the Tartar Grande distrito Baños del Inca, región Cajamarca, Perú. Mediante el crecimiento Hamlet, Baños del Inca District, Cajamarca Region, Peru. Through en agar MacConkey-MUG fueron seleccionadas trece muestras growth on MacConkey-MUG agar, thirteen samples were selected, caracterizándose bioquímicamente mediante kit EnteroPluri®-Test characterized biochemically using the EnteroPluri®-Test kit and e identificadas molecularmente mediante amplificación del gen uidA molecularly, the strains were identified by amplification of the uidA mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR); se gene using the polymerase chain reaction (PCR) technique; the tipificó el filogrupo por PCR cuádruplex de Clermont. Las cepas locales phylogroup was typified by Clermont quadruplex PCR. The isolated local aisladas mostraron un perfil bioquímico fermentadoras de sorbitol strains showed a sorbitol and glucose fermenting biochemical profile, y glucosa permitiendo agruparlas e identificarlas en cinco grupos allowing them to be grouped and identified into five groups (codes (códigos 71340; 71350; 51340; 61740 y 61340); además se amplificó el 71340; 71350; 51340; 61740 and 61340); In addition, the uidA gene that gen uidA que codifica la enzima beta-glucuronidasa propias del linaje encodes the beta-glucuronidase enzyme typical of the E. coli lineage de E. coli. La identificación del grupo filogenético permitió observar was amplified. The identification of the phylogenetic group allowed que están agrupadas en el grupo B1 (69,23 %), F (15,38 %), además los to observe that they are grouped in group B1 (69.23 %), F (15.38 %), in grupos A (7,69 %) y D o E (7,69 %) se distribuyen proporcionalmente addition to groups A (7.69 %) and D or E (7.69 %) respectively. It was en todas las muestras analizadas, se logró mediante amplificación de achieved by amplification of the arpA, chuA, yjaA, TspE4.C2 genes. los genes arpA, chuA, yjaA, TspE4.C2. Las cepas locales aisladas de The local strains isolated from feces of calves with diarrhea represent heces de terneros con diarrea representan poblaciones bacterianas naturalized bacterial populations adapted to the ecological niche of naturalizadas y adaptadas al nicho ecológico de Cajamarca, teniendo la Cajamarca, having regional livestock as the main source of food for ganadería regional como principal fuente de alimentación las pasturas, pastures, possibly contamination of these translates into an important posiblemente la contaminación de estas se traduce en un importante means of transmission in calves for the presentation of colibacillosis, medio de transmisión en terneros para la presentación de colibacilosis, since these strains harbor the highest proportion of virulence genes. ya que estas cepas albergan la mayor proporción de genes de virulencia. Key words: Escherichia coli; Clermont; biochemical characterization; Palabras clave: Escherichia coli; Clermont; caracterización; filogrupos phylogroups Recibido: 13/01/2022 Aceptado: 27/02/2022 Publicado: 31/05/2022 1 de 10 Caracterización bioquímica y filogrupos de Escherichia coli aislados en Perú / Cabrera-González y col. ___________________________________ INTRODUCCIÓN entre este clado y E. coli [33]. Motivo por lo cual se reconocen ocho Escherichia coli es una especie bacteriana versátil por su alta grupos: siete como A, B1, B2, C, D, E, F que pertenecen a E. coli morbilidad, así como la variedad en síndromes y cuadros clínicos sensu stricto, mientras que el octavo es Escherichia cryptic clade I. asociados a las infecciones por este patógeno; se encuentra presente El método de Clermont establece principalmente la vinculación entre en el tracto digestivo de muchos vertebrados, incluido el hombre [11], el grupo filogenético y la virulencia mediante la determinación de los en la mayoría de los animales se considera como habitante normal de genes chuA, yjaA, TspE4.C2 y arpA [6, 48]. Finalmente, el objetivo del los intestinos [41], incluyendo los humanos, como sucede con las cepas presente estudio fue la caracterización bioquímica e identificación patógenas que causan diversas infecciones intra y extra intestinales. de grupos filogenéticos de cepas locales de E. coli aisladas, de heces A pesar del extenso flujo de genes entre las cepas, la especie E. coli de terneros con diarrea, mediante el método de Clermont. tiene una estructura de población globalmente clonal, que consiste en distintos grupos filogenéticos [2, 11]. En Cajamarca, Perú, de 314 MATERIALES Y MÉTODOS muestras de agua potable, se identificaron coliformes termotolerantes (CT) en 55,4 % y entre las muestras positivas para CT, E. coli se aisló en Muestras y cepas bacterianas 37,3 %; Klebsiella spp. en 8,0 %; Enterobacter spp. en 5,1 % y Citrobacter Entre enero y marzo de 2019 se recolectó un total de 32 muestras spp. en 2,5 %. De estos aislados de E. coli, un 48,7 % mostró resistencia fecales diarreicas en terneros de hasta 1 mes post nacimiento, de raza a los antibióticos [29]; reconociéndose la resistencia que presentan las Holstein, en 08 fundos ganaderos ubicados en el caserío de Tartar bacterias frente a los diversos antibióticos como un grave problema Grande: El Triunfo (7°9'10.08" S, 78°28'18.81" O); La Merced (7°8'13.22" para la salud pública a escala global [37]. S, 78°28'52.45" O); La Victoria (7°11'32.06" S, 78°27'51.3" O); Rabanal La diarrea de terneros (Bos taurus) asociada con patógenos (7°7'33.61" S, 78°26'52.59" O); San Antonio (7°9'12.32" S, 78°28'27.89" O); infecciosos es un problema importante para los productores de San Vicente de Paul (7°9'12.15" S, 78°28'24.62" O); Santa Teresa (7°9'21.87" lácteos de todo el mundo [17, 18, 28]. Así la mortalidad y los costos S, 78°28'6.43" O); Tartar UNC (7°9'46" S, 78°28'25.34" O); distrito de Baños de tratamiento son causas importantes de pérdidas económicas del Inca, Región de Cajamarca, Perú (FIG. 1). para la industria láctea [14]. Las E. coli genéricas son una población El aislamiento se realizó en los laboratorios de Biotecnología en abundante de bacterias entéricas comensales en animales y humanos y Sanidad Animal de la Estación Experimental Agraria Baños del Inca son ubicuas en el medio ambiente [13, 48]. Debido a la gran importancia y Microbiología Veterinaria de la Universidad Nacional de Cajamarca, que se da a esta bacteria en la medicina, se determina y clasifica la E. Cajamarca coli en cepas patógenas y no patógenas, encontrándose a disposición diferentes métodos, entre los que cabe indicar: perfil bioquímico, Las muestras fueron tomadas directamente del recto mediante pato tipificación, serotipificación, análisis filogenético [20]. Así bolsas de propileno de primer uso. Aproximadamente 1 gramo (g) de mismo, es posible identificarlas mediante electroforesis de enzimas heces fue diluido en 10 mililitros (mL) de agua peptonada tamponada multilocus, tipificación multilocus de secuencias, reacción en cadena al 1 %, incubando luego a 37° C durante 24 horas (h) en estufa (Estufa de la polimerasa (PCR) mediante la utilización de un termociclador universal Memmert UN-110/ Schwabach/Alemania). PCRmax, AC 196, Reino Unido y sus respectivas variantes [10, 20, 36]. También la E. coli patógena causa millones de casos de disentería, Caracterización bioquímica mientras que E. coli no patógena se considera como parte normal de la flora intestinal en los mamíferos y en las aves [49]. Los ensayos fueron realizados empleando el kit EnteroPluri ®-Test fermentación (glucosa, adonitol, lactosa, arabinosa, sorbitol, dulcitol); Según el análisis filogenético se reporta que, E. coli está compuesta producción (gas, ácido sulfhídrico (H2S), indol, producción de acetoína por cuatro grupos filogenéticos, siendo los principales, A, B1, B2 y D y /Voges-Proskauer); descarboxilación (lisina, ornitina); desaminación que las cepas extra intestinales virulentas pertenecen principalmente (fenilalanina); hidrólisis de urea; utilización de citrato para identificar a los grupos B2 y D [12]. La determinación estructural de E. coli con entero bacterias y otras bacterias Gram (-). respecto a su fuente de aislamiento fueron los filogrupos B2 o D cepas causantes de infección intestinal [25, 39]. Posteriormente mediante Posteriormente, una alícuota con 4 microlitros (µL) de la muestra PCR se determinó la presencia de los genes chuA, yjaA y un fragmento sembrada en caldo peptonado fue sembrada por estrías en placa de ADN TspE4.C2, además se caracterizó un gen putativo de lipasa con Agar MacConkey MUG (Liofilchem–REF.610170), incubándose esterasa [20]; por lo que basado en la presencia o ausencia de estos (Memmert/ICO-50/Schwabach/Alemania) en condiciones aeróbicas 3 genes se podría clasificar los filogrupos en A, B1, B2 y D [12]. a 35°C durante 24 h, identificando las colonias rosadas que fluorescen azul-verde bajo luz ultra violeta (UV) en el rango de 366 nanómetros Estudios de tipificación multilocus de secuencias – MLST y del (nm). Una o dos colonias de cada muestra fueron seleccionadas con genoma de E. coli posibilitaron la mejora en su comprensión y de la características Gram (–) y oxidasa (-) para ser utilizadas en los ensayos subestructura, así se reconoce la existencia del filogrupo E pequeño bioquímicos para su identificación como colonias de E. coli mediante el conjunto que no habían sido asignadas y donde la cepa O157:H7 es el kit EnteroPluri®-Test–Liofilchem (certificado de calidad N° 78618–78619). más representativo [42]. En la actualidad se reconoce al filogrupo Posteriormente según instrucciones del protocolo del fabricante se F las cuales son cepas hermanas del filogrupo B2 [11, 42]. Estudios realizó la interpretación de reacción (TABLA I) recientes han permitido proponer al filogrupo C el cual se relacionaba al filogrupo B1 del cual difiere [11, 34]. Posteriormente se asignaron código según reacción bioquímica, los que se dividen en 5 grupos que contienen 3 test y cada test se Otros investigadores como Luo y col. [33] informaron sobre indica con un valor de positividad de 4; 2; 1, según corresponda: Valor linajes nuevos de cepas de E. coli genéticamente distintas, pero 4: cebadores test positivo de cada grupo (Glucosa, Ornitina, Adonitol, fenotípicamente indistinguibles [47], por lo que al menos uno de Sorbitol, Fenilalanina); Valor 2: segundo test positivo de cada grupo (Gas estos linajes de E. coli clado I basado en el grado de recombinación H2S, Lactosa, Voges-Proskauer, Urea); Valor 1: tercer test positivo de 2 de 10 ________________________________________________________________________Revista Cientifica, FCV-LUZ / Vol. XXXII, rcfcv-e32112, 1 - 10 FIGURA 1. Distribución geográfica de los 08 fundos muestreados. Caserío Tartar-Grande, Baños de Inca, Cajamarca, Perú, 2019 cada grupo (Lisina, Indol, Arabinosa, Dulcitol, Citrato); Valor 0: cada test Reino Unido, mediante concentración y densidad óptica predispuesta negativo. Sumando a cada grupo los números de la reacción positiva en el espectrofotómetro se determinaron las Unidades Formadoras de se obtuvo un código de 5 cifras que utiliza el manual de códigos del Colonia (UFC) a 600 nm, para contabilizar el crecimiento de bacterias test EnteroPluri-Test lo que permitió identificar al microorganismo. viables en el medio líquido. La extracción de la plantilla de ADN de E. coli fue realizada mediante kit de purificación Wizard® Genomic DNA Extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN) (Promega, REF. A1120), según instrucciones del fabricante, el ADN obtenido fue almacenado en refrigeración utilizando una refrigeradora Dos o tres colonias de E. coli seleccionadas se cultivaron en medio Samsung, RT35K5930S8/PE, Samsung, México de 4°C, el cual fue líquido 2xYT (Sigma, REF. Y2377) a 37°C. por 18 h y se evaluó utilizando utilizado como plantilla para los diversos ensayos de PCR. un espectrofotómetro PCR MAX Lambda 64272, Bibby Scientific Ltd, TABLA I Reacción bioquímica mediante kit EnteroPluri®-Test Sectores Reacción Bioquímica Reacción (+) Reacción (–) Glucosa / Fermentación de la glucosa y producción de gas en anaerobiosis Amarillo Rojo Gas Producción de gases Cera suelta Cera adherida Lisina Descarboxilación de la lisina en anaerobiosis Violeta Amarillo Ornitina Descarboxilación de la ornitina en anaerobiosis Violeta Amarillo H2S / Producción de hidrógeno saturado Negro-marrón Beige Indol Producción de indol Rosa-rojo Incoloro Adonitol Fermentación del adonitol Amarillo Rojo Lactosa Fermentación de la lactosa Amarillo Rojo Arabinosa Fermentación de la arabinosa Amarillo Rojo Sorbitol Fermentación del sorbitol Amarillo Rojo Voges-Proskauer Producción de acetoina Rojo Incoloro Dulcitol / Fermentación del dulcitol Amarillo Verde Fenilalanina Deaminación de la fenilalanina Marrón Oscuro Verde Urea Hidrólisis de la urea Púrpura Beige Citrato Utilización del citrate Azul Verde 3 de 10 Caracterización bioquímica y filogrupos de Escherichia coli aislados en Perú / Cabrera-González y col. ___________________________________ Análisis para identificación y determinación /filogrupo RESULTADOS Y DISCUSIÓN La identificación molecular de E. coli procedentes de terneros con diarrea se determinó mediante PCR empleando “cebadores” Aislamiento de cepas (F 5'-TCAGCGCGAAGTCTTTATACC-3'; R 5'-CGTCGGTAATCACCATTCCC-3'), Del total de muestras recogidas de campo y sembradas en agar para amplificación del gen uidA (248pb), [25, 27]. El perfil térmico de la MacConkey MUG se seleccionaron 13 muestras, como cultivos reacción de PCR fue: desnaturalización inicial 94°C—2 minutos (m), 25 positivos de E. coli. ciclos (desnaturalización 94°C—30 segundos (s); hibridación 55°C—30 s; extensión 72°C—45 s) y extensión final 72°C—2 m. Caracterización bioquímica Los fragmentos de ADN amplificado para identificar la cepa de E. Se pudo determinar que las cepas aisladas de E. coli provenientes de coli y filogrupo se separaron por su tamaño mediante electroforesis muestras de terneros con diarrea (TABLA III) las que fueron agrupadas —agarosa 1 %. El análisis de los fragmentos se realizó a través de tinción de acuerdo a positividad (+) o negatividad (-) de la reacción bioquímica del gel con Sybr Green (Thermo Fisher) y su observación fue realizada en cinco grupos con código : 71340 + (glucosa, gas, lisina, indol, lactosa, en transiluminador UV 302 nm Labnet U1001 Taiwan [50]. arabinosa, sorbitol); – (ornitina , H2S, adonitol, Voges-Proskauer, dulcitol, Para determinar filogrupo A, B1, B2, C, D, E o F en E.coli de las fenilalanina, urea, citrato). 71350 + (glucosa, gas, lisina, indol, lactosa, muestras diarreicas, se usó un PCR–cuádruplex, basado en la arabinosa, sorbitol, dulcitol); – (ornitina, H2S, adonitol, Voges-Proskauer, amplificación de genes chuA, yjaA, TspE4.C2 y arpA [9] (TABLA II). fenilalanina, urea, citrato). 51340 + (glucosa, lisina, indol, lactosa, arabinosa, sorbitol); – (gas, ornitina, H2S, adonitol, Voges-Proskauer, La amplificación se realizó en un volumen de 20 µL, conteniendo dulcitol, fenilalanina, urea, citrato). 61740 + (glucosa, gas, indol, adonitol, 4 µL de tampón 5X (suministrado con Taq polimerasa), dNTPs 0,6 µL lactosa, arabinosa, sorbitol); – (lisina, ornitina, H2S, Voges-Proskauer, (2,5 microMol [µM]), Taq Polimerasa 0,2 unidades (U), 2,8 µL de ADN dulcitol, fenilalanina, urea, citrato). 61340 + (glucosa, gas, indol, lactosa, aproximadamente 100 nanogramos (ng)·mL-1). Los cebadores que se arabinosa, sorbitol); – (lisina, ornitina, H2S, adonitol, Voges-Proskauer, utilizaron fueron chuA-FR (1µL·10 µM-1), yjaA-FR (1µL·10 µM-1), TspE4. dulcitol, fenilalanina, urea, citrato), presentando reacción negativa en C2-FR (1µL·10 µM-1) y arpA (1µL·10 µM-1). todas las cepas aisladas para la reacción bioquímica de fenilalanina, El perfil térmico de la reacción de amplificación empleado fue: urea y citrato. desnaturalización inicial 94°C—4 m, 30 ciclos (desnaturalización Se realizó un dendograma de clasificacion según Ward para asignar 94°C —5 s, hibridación 57°C—20 s, extensión 59°C—20 s) y extensión puntaje elaborado, 4; 2; 1, para los diferentes procesos bioquímicos final 72°C—5 m. indicados en el kit EnteroPluri®-Test en la identificación de cepas de E. coli, donde se pudo observar en el clúster 1 que las características que Análisis estadístico presentan las cepas de E. coli, es mayor en actividad sobre la glucosa Se realizó mediante el software SPSS para Windows (V. 24.0; IBM. y el sorbitol, luego por preponderancia continua el clúster 2, que son Corp., Armonk, Nueva York, Estados Unidos). Se utilizó el método fermentadoras de lactosa, y productoras de gas, y el tercer clúster de de clasificación jerárquica para las variables evaluadas (pruebas baja relevancia se encuentran la mayoría de los componentes como bioquímicas: glucosa, gas, lisina, ornitina, H2S, indol, adonitol, lactosa, Lisyna, Ornitina, H2S, Indol, Arabinosa, Voges-Proskauer, Dulcitol, Urea, arabinosa, sorbitol, Voges-Proskauer, dulcitol, fenilalanina, urea, citrato), Citrato (FIG. 2). la agrupación de clústeres se realizó mediante Criterio de varianza mínima de Ward. Identificación molecular y filogrupo de E. coli Para la identificación de cepas locales de E. coli presentes en heces de terneros con diarrea, se amplificó el gen uidA el cual codifica la enzima β–glucoronidasa. El análisis de los productos de amplificación TABLA II Secuencia de cebadores para identificación de filogrupos de Escherichia coli Gen Objetivo Secuencia de los cebadores Producto PCR (pb) Referencia chuA.1b F5'-ATGGTACCGGACGAACCAAC-3' chuA 288 Clermont y col. (2013) chuA.2 R5'-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3' yjaA.1b F5'-CAAACGTGAAGTGTCAGGAG-3' yjaA 211 Clermont y col. (2004) yjaA.2b R5'-AATGCGTTCCTCAACCTGTG-3' TspE4C2.1b F5'-CACTATTCGTAAGGTCATCC-3' TspE4.C2 152 Clermont y col. (2004) TspE4C2.2b R5'-AGTTTATCGCTGCGGGTCGC-3' ArpAgpE.f F5'-GATTCCATCTTGTCAAAATATGCC-3' arpA 301 Lescat y col. (2012) ArpAgpE.r R5'-GAAAAGAAAAAGAATTCCCAAGAG-3' 4 de 10 ________________________________________________________________________Revista Cientifica, FCV-LUZ / Vol. XXXII, rcfcv-e32112, 1 - 10 TABLA III Generación de código de identificación de cepas de Escherichia coli según reactividad a pruebas bioquímicas, mediante kit EnteroPluri®-test Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Test Código positivo 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 Resultados + + + - - + - + + + - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - Código 7 1 3 5 0 Identificación 71350 / Escherichia coli Código positivo 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 Resultados + + + - - + - + + + - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - Código 7 1 3 5 0 Identificación 71350 / Escherichia coli Código positivo 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 Resultados + - + - - + - + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Código 5 1 3 4 0 Identificación 51340 / Escherichia coli Código positivo 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 Resultados + + - - - + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Código 6 1 7 4 0 Identificación 61740 / Escherichia coli Código positivo 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 4 2 1 Resultados + + - - - + - + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Código 6 1 3 4 0 Identificación 61340 / Escherichia coli FIGURA 2. Evaluación de la sensibilidad, mediante el métodos de clasificación jerárquica para las variables evaluadas (reacción bioquímica), la agrupación de clústeres se realizó mediante criterio de varianza mínima de Ward, distancia euclidiana cuadrada, utilizando el software Minitab (Versión 19.2020.1; licencia 6MJYXQIJGKZWLEYHARYW) 5 de 10 Glucosa Gas Lisina Ornitina Ácido sulfhídrico Indol Adonitol Lactosa Arbnsa Sorbitol Producción acetoina (VP) Dulcitol Fenilalanina Urea Citrato Caracterización bioquímica y filogrupos de Escherichia coli aislados en Perú / Cabrera-González y col. ___________________________________ fue realizado mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %, método pares de base (pb) positivas para la región amplificada del gen uidA. simple y eficaz para separar, así también, identificar y purificar El mismo fue detectado en el 92,30 % de las muestras analizadas, fragmentos de ADN entre un peso molecular de 0,5 a 25 kb [46]. lo cual evidencia la identificación de E. coli, dado que este gen es Se observaron bandas electroforéticas del tamaño esperado: 248 específico para esta bacteria (FIG. 3). FIGURA 3. Análisis de amplicones mediante electroforesis en gel de agarosa (1 %), del gen uidA. Carril 1 Marcador de 100 pb. Muestras positivas en todos los carriles La relación de filogrupo en E. coli aisladas se determinó mediante cepas son portadoras los genes de virulencia en el ganado vacuno Clermont y col. [9], basándose en productos amplificados por PCR productora de leche [45]. cuádruplex correspondiente a los genes chuA (288 pb), yjaA (211 pb), fragmento de ADN TspE4.C2 (152 pb), arpA (301 pb), la amplificación de El método de PCR cuádruplex de Clermont se ha observado que los genes se relacionó con la identificación de filogrupos encontrados es útil en la identificación filogenética de E. coli por ser económico, en las muestras analizadas A, B1, D o E y F. (TABLA II). fácil de utilizar y con buen rango de eficacia se basa en la evaluación del gen yjaA que codifica una proteína hipotética, en el genoma de E. Se pudo observar que el porcentaje de filogrupos encontrados en coli K-12; gen chuA está ubicado en la membrana externa importante las 13 muestras aisladas de terneros con diarrea están ubicadas en en el transporte de hemo de la cepa O157:H7; una secuencia de ADN el grupo B1 (69,23 %), F (15,38 %), mientras que los grupos A (7,69 %) TspE4.C2 ubicada dentro de un gen que codifica lipasa esterasa [15] y D o E (7,69 %), respectivamente. Lo que sugiere que las cepas B1 y el gen arpA que codifica la proteína de repetición de arquinina [9]. mantienen poblaciones ligeramente mayores que sus contrapartes y está asociado principalmente a terneros con problemas de diarrea La presencia de genes amplificados en gel de agarosa al 1 % para por motivo que este filogrupo es más virulento debido a que estas la determinación de los filogrupos se puede observar B1, F, A, D o E. (TABLA IV) TABLA IV Patrón de filogrupo determinado en muestras fecales de terneros. Tartar-Grande, Baños de Inca, Cajamarca, Perú, 2019 Aislado Gen arpA Gen chuA Gen yjaA Fragmento TspE4.C2 Grupo a1 + - - + B1 a2 + - - + B1 a3 + - - + B1 a4 + - - + B1 a5 + - - + B1 a6 + - - + B1 a7 + - - + B1 a8 + + - - D o E a9 + - - + B1 a10 + - - + B1 a11 + - - - A a12 - + - - F a13 - + - - F B1 (+ – – +), F ( – + – -), A (+ – – -), D o E (+ + – -) 6 de 10 ________________________________________________________________________Revista Cientifica, FCV-LUZ / Vol. XXXII, rcfcv-e32112, 1 - 10 E. coli se encuentra en la flora intestinal en animales y humanos [26], investigaciones realizadas por Asim y col. [3] muestran amplificaciones pudiendo producir enfermedad, la cual cursa con diarrea frecuentemente del gen uidA similares a las encontradas en los resultados mediante en terneros jóvenes principalmente durante los primeros días de vida [1], PCR basándose en regiones específicas del gen, no observándose ocasionando importantes pérdidas económicas para los productores en amplificación para otras bacterias entéricas y no entéricas [3]. todo el mundo [8, 17, 48]. Con la finalidad de conocer las características Otros investigadores como Liy y col. [32] mencionan que, el género bioquímicas, filogrupo de E. coli en muestras diarreicas de terneros Escherichia comprende muchas especies, entre los cuales se tienen en la Región Cajamarca, Perú, se identificaron 13 muestras mediante E. coli, E. hermanii, E. vulneris, E. fergusonii, E. albertii y E. marmotae EnteroPluri®-Test, para la identificación de enterobacterias; habiéndose siendo, todas las cepas utilizadas provenientes del tracto intestinal comprobado que los aislados correspondían a E. coli; pudiéndose bovino, de muestras aisladas de terneros relacionados son síntomas observar que el 100 % de cepas cultivadas mostraron sorbitol lo cual de enfermedad diarreica, están dentro de la especie E. coli. concuerda con otros resultados reportados por Picard y col. [39, 44], como lo que se menciona, que en estudio realizado en Chile donde 56 En cuanto a la clasificación de filogrupo de E. coli a partir de las muestras de carne de bovino contaminadas con esta bacteria fueron muestras diarreicas de terneros, se han basado en la utilización del fermentadoras de sorbitol hasta un 98,2 %. protocolo de trabajo de agrupación publicado por Clermont y col. [9], lo cual permitió observar que estas cepas locales de E. coli se encontraban Otros estudios realizados por Orth y col. [38] reportan una infección en el filogrupo B1 en mayor proporción y en el filogrupo A en menor por E. coli de una familia de granjeros de Salzburgo – Austria, de la proporción, siendo ambos grupos asociados a procesos ambientales, cual las muestras procedían de 42 animales de la granja siendo todas representando a poblaciones bacterianas naturalizadas y adaptadas fermentadoras de sorbitol (identificado por API 20E; bioMérieux, al nicho ecológico y asociado principalmente a contaminación de las Marcy-l’Etoile, Francia) post incubación en agar MacConkey sorbitol. pasturas, lo que se traduce en un importante medio de transmisión en Teniendo en cuenta que las muestras obtenidas procedían de terneros terneros para la presentación de colibacilosis, ya que estas poblaciones con diarrea, al observar la positividad de estas cepas a la prueba bacterianas pueden ser naturalizadas, pudieron haber sobrevivido a las bioquímica del D-Sorbitol, el cual es un carbohidrato fermentable, condiciones ambientales de la región de Cajamarca y se adaptaron a las donde la mayoría de las cepas hemorrágicas de E. coli no fermentan se pasturas que sirven como alimentación del ganado [7, 23, 43], ya que es puede mencionar que, esto fue reportado por primera vez en Alemania, una especie versátil que abarca comensales inofensivos, así también constituyéndose como un patógeno emergente, capaz de producir cepas patógenas con la capacidad de causar infección intestinales o enfermedad potencialmente mortal, presentándose en un 10 a 20 % de extraintestinal en muchos huéspedes como humanos y animales [31]. los casos esporádicos y además provocando brotes más importantes y Los resultados obtenidos en cuanto al filogrupo B1 encontrado se de mayor magnitud [4]. Por lo que se sugiere que el ganado vacuno puede asemejan a otras investigaciones realizadas, donde se menciona que albergar cepas locales de E. coli fermentadoras del sorbitol, teniendo este grupo es el más numeroso hallado en pasturas para ganado en en cuenta que E. coli 057:H7 no fermentadora de sorbitol está presente donde se reporta aislamientos del grupo B1 (66 %) en muestras de suelo, en este reservorio animal [5], la cual es productora de la toxina shiga (32 %) en heces de bovinos y (40 %) en pasturas [19] y hay que tener E. coli 0157:H7, presente en infecciones entéricas graves, incluyendo en cuenta que los grupos B1 y A pueden constituirse como patógenos colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico [35]. intestinales y provocar enfermedad en los terneros [40]. La importancia de la identificación y amplificación del gen uidA Es así que, con los datos obtenidos se puede considerar que los mediante PCR, se da debido a que es un gen específico del linaje de factores de virulencia se asocian al filogrupo siendo importante esta E. coli [21] y es utilizado a menudo en muchas investigaciones por característica, debido que en la región Cajamarca el filogrupo B1 se ser especifico [22]. Bajo este mismo contexto , la amplificación presenta en mayor proporción, las cepas portadoras de este grupo tienen realizada a la región del gen uidA utilizando ADN extraído de los cultivos mayores genes de virulencia en ganado vacuno lechero [45]. Por otro lado, identificados mediante pruebas bioquímicas, generaron amplicones Tenaillon y col. [42] mencionan que, la evidencia en determinar que los específicos del tamaño esperado (FIG. 4); coincidiendo con otros diferentes grupos filogenéticos juegan distintos roles ecológicos; como estudios publicados que confirman, que mediante amplificación por ejemplo en humanos, se presentan principalmente los filogrupos A dirigida al gen uidA se puede detectar en forma directa E. coli [22]. Otras (40 %) y B2 (25,5 %) y en menor proporción son menos prevalentes los FIGURA 4. A) Perfil PCR cuádruplex, método de tipificación de filogrupo–Clermont en muestras de heces aisladas de E. coli de terneros con diarrea observadas mediante electroforesis – agarosa 1 %. Marcador 100 pb; Carriles M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M9 y M10 (grupo B1); M8 (grupo D o E); M11 (grupo A); M12 y M13 (grupo F). B) Porcentaje de distribución de los filogrupos 7 de 10 Caracterización bioquímica y filogrupos de Escherichia coli aislados en Perú / Cabrera-González y col. ___________________________________ filogrupos B1 y D (17 %); mientras que en animales los filogrupos más Plasmid Composition Not Previously Seen in German Isolates prevalentes son B1 (41 %) siguiendo A (22 %), B2 (21 %) y D (16 %), con lo Appl. Environ. Microbiol. 83(23): e01454-17. 2017. https://doi. cual se demuestra que el filogrupo encontrado en terneros en la región org/hwwb. de Cajamarca es también el filogrupo B1. Además, se observaron cepas pertenecientes al filogrupo F, las cuales son cepas provenientes de [5] BIELASZEWSKA, M.; SCHMITD, H.; LIESEGANG, A.; PRAGER, R.; reservorios animales, considerándolas como comensales del intestino RABSCH, W.; TSCHÄPE , H.; CIZEK, A.; JANDA, J.; BLAHOVA, K.; de animales, pudiendo causar enfermedades diarreicas extraintestinales KARCH, H. Cattle can be a reservoir of sorbitol-fermenting Shiga severas [30]; es importante tener en cuenta en cuanto al filogrupo F está toxin-producing Escherichia coli O157:H strains and a source of formado por un grupo hermano relacionado con el filogrupo B2 [11, 24]. human diseases. J. Clin. Microbiol. 38(9): 3470-3473. 2000. Por otra parte, en los resultados del presente estudio se observó la [6] BINGEN, E; PICARD, B; BRAHIMI, N; MATHY, S; DESJARDINS, P; existencia de cepas de los filogrupos pertenecientes a D o E (+ + – -) según ELION, J; DENAMUR, E. Phylogenetic Analysis of Escherichia coli la clasificación de Clermont y col. [9], otras investigaciones manifiestan Strains Causing Neonatal Meningitis Suggests Horizontal Gene que estos filogrupos están relacionados, así también mencionan que Transfer from a Predominant Pool of Highly Virulent B2 Group el filogrupo F está relacionado con el grupo filogrupo B2, grupo que se Strains. J. Infect. Dis. 177(3): 642-650. 1998. https://doi.org/cx5fvw. presenta más en humanos [16, 39]. Esto posiblemente se deba al medio [7] BRENNAN, F.P.; O’FLAHERTY, V.; KRAMERS, G.; GRANT, J.; ambiente, anatomía del intestino, condiciones medio ambientales del RICHARDS, K.G. Long-term persistence and leaching of Escherichia nicho ecológico, que influyen en la estructura filogenética de E. coli, coli in temperate maritime soils. Appl. Environ. Microbiol. 76: 1449- aisladas de muestras de terneros con diarrea [42]. 1455. 2010. https://doi.org/dkcjms. [8] CHO, Y.I.; YOON, K.J. An overview of calf diarrhea-infectious CONCLUSIONES etiology, diagnosis, and intervention. J. Vet. Sci. 15: 1–17. 2014. La identificación de cepas bacterianas locales, aisladas de muestras https://doi.org/f5wkwh. fecales de terneros identificados mediante amplificación del gen [9] CLERMONT, O.; CHRISTENSON, J.K.; DENAMUR, E.; GORDON, uidA especifico del linaje de E. coli, las cuales son principalmente D.M. The Clermont Escherichia coli phylo-typing method revisited: fermentadoras de sorbitol y que presentan un perfil filogenético Improvement of specificity and detection of new phylo-groups. mayoritariamente del grupo B1, permite concluir que se trata de Environ. Microbiol. 5(1): 58-65. 2013. https://doi.org/f4nr28. poblaciones bacterianas naturalizadas y adaptadas al nicho ecológico de la región de Cajamarca, Perú, teniendo la ganadería regional [10] CLERMONT, O.; GORDON, D.; DENAMUR, E. Guide to the various como principal fuente de alimentación las pasturas posiblemente phylogenetic classification schemes for Escherichia coli and the la contaminación de estas se traduce en un importante medio de correspondence among schemes. Microbiol. 161: 980-988. 2015. transmisión en terneros para la presentación de colibacilosis, ya que https://doi.org/hwwc. estas cepas albergan la mayor proporción de genes de virulencia. [11] CLERMONT, O.; OLIER, M.; HOEDE, C.; DIANCOURT, L.; BRISSE, Además, se requiere realizar más estudios de caracterización de S.; KEROUDEAN, M. Animal and human pathogenic Escherichia estos aislamientos bacterianos incluidos su adaptación al medio coli strains share common genetic backgrounds. Infect. Genet. ambiente y grado de patogenicidad. Evol. 11(3): 654-662. 2011. https://doi.org/djjcq8. CONFLICTOS DE INTERESES [12] CLERMONT, O; BONACORSI, S; BINGEN, E. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Appl. Los autores declaran que no existe ningún tipo de conflicto de Environ. Microbiol. 66(10):4555-4558. 2000. https://doi.org/ intereses con la publicación de la presente investigación. ckvvd2. [13] CROXEN, M.A; LAW, R.J; SCHOLZ, R; KEENEY, K.M; WLODARSKA, REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS M; FINLAY, B.B. Recent Advances in Understanding Enteric [1] ACRES, S.D. Enterotoxigenic Escherichia coli infections in newborn Pathogenic Escherichia coli. Clin. 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