Recibido, 23/02/2020 Aceptado, 15/03/2020 DOI:10.25127/aps.20201.510 Artículo original Control de la contaminación microbiana empleando bajas concentraciones de ozono e hipoclorito de sodio al interior de contenedores de polietileno empleados en biorreactores de inmersión temporal Control of microbial contamination using low concentrations of ozone and sodium hypochlorite inside of polyethylene containers used as temporary immersion bioreactor Henri Delgado Haya1* , Alexander Altamirano Salazar1, Mar Asunción Gárate Navarro1 , Juliana Rodríguez García1, Marco Antonio León Martínez2 RESUMEN El propósito del trabajo de investigación fue caracterizar y aislar yemas axilares de piña a partir de cormos, y utilizarlos como explantes para su diferenciación en plantas enteras. Después de cuatro subcultivos consecutivos, plantas individuales fueron acondicionadas dentro de contenedores de sistemas de inmersión temporal para su establecimiento y multiplicación. Como segundo propósito de nuestra investigación fue evaluar el efecto antimicrobiano de cuatro diferentes concentraciones (mg) de ozono y cuatro diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio NaOCl (%) al interior de contenedores de polietileno utilizados para la multiplicación de plantas en un sistema de inmersión temporal. Nuestros resultados demuestran que el acondicionamiento in vitro de yemas axilares procedente de cormos de piña, consiguen diferenciarse en plantas totalmente enteras e independientes hasta los 120 días. Asimismo, la utilización de ozono superior a 100 mg/contenedor disminuye la contaminación microbiana, así como, la utilización de una mayor concentración de 0,05% de cloro activo. Sugiriendo que la utilización de bajas concentraciones de ozono e hipoclorito de sodio garantiza la inocuidad interna de recipientes de polietileno frágiles a recibir elevadas temperaturas (autoclavado) como un método tradicional de esterilización. Palabras clave: piña, ozono, hipoclorito de sodio, sistemas de inmersión temporal. ABSTRACT The purpose of this research was characterize and isolate the axillary buds of pineapple from corm, and use them as explants for their differentiation in whole plants. After four consecutive subcultures, individual plants were conditioned inside to containers of temporary immersion systems for their establishment and multiplication. As the second purpose of our research was to evaluate the antimicrobial effect of four different concentrations (mg) of ozone and four different concentrations of sodium hypochlorite NaOCl (%) inside of polyethylene containers used for plant multiplication in a temporary immersion system. Our results show that the in vitro establishment of axillary buds from pineapple corms, can be differentiated in completely whole and independent plants up to 120 days. Furthermore, the use of ozone more than 100 mg/container decreases microbial contamination, as well as the use of a higher concentration of 0.05% of active chlorine. Suggesting that the use of low concentrations of ozone and sodium hypochlorite ensures the internal safety of fragile polyethylene containers to receive high temperatures (autoclaving) as a traditional method of sterilization. Key words: pineapple, ozone, sodium hypochlorite, temporal immersion system. 1 Instituto Nacional de Innovación Agraria, Estación Experimental Agraria El Porvenir San Martín, Tarapoto, Perú 2 Instituto de Investigación Biológica de las Cordilleras Orientales, Tarapoto, Perú *Autor de Correspondencia, e-mail: henri.delgado12@gmail.com Rev. de investig. agroproducción sustentable 4(1): 1-7, 2020 ISSN: 2520-9760 1 Control microbiano biorreactoes inmersión temporal Delgado H I. INTRODUCCIÓN 5L (Saxena et al., 2003). El uso de recipientes de El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro es mayor capacidad, como los utilizados en biorreactores considerado como una herramienta biotecnológica resultan tener una mayor complicación (Ma et al., empleada en la micropropagación de plantas a gran 2017), cuando se quiere realizar una esterilización escala y en espacios reducidos. Donde cada explante, interna (Zhao et al., 2013). Esto debido a su gran tama- considerado como cualquier porción vegetal explota ño y al material con que podría ser fabricado (no auto- su potencial intrínseco o inducido (Thorpe, 1981). La clavable), buscando controlar metodologías de esteri- maximización de la micropropagación va más allá de lización de recipientes (Ogunsona et al., 2019), en un cultivo in vitro convencional. El uso de biorreacto- experimentos realizados para contenedores de antioxi- res para la micropropagación de plantas es un método dantes (Dias et al., 2018), y el uso del ozono para la que tiene como objetivo la multiplicación masiva de industria alimenticia (Kim et al., 2003). Con la finali- plantas, muchas veces con un enfoque de industria en dad de buscar una metodología de esterilización de la propagación de plantas. La contaminación es uno de recipientes de mayor capacidad (contenedores), que los principales problemas a resolver en cultivo in vitro, excluya la posibilidad de usar un autoclave, el objetivo puede originarse de dos fuentes distintas: aquellos de la investigación fue estudiar el efecto antimicrobia- provenientes de la superficie o tejidos de la planta no de pequeñas concentraciones de hiplocorito de donadora y aquellos que surgen como resultados de sodio (%) y ozono (mg), lo cual fue probado con micro fallas en los procedimientos de laboratorio. En las bacterias en distribuciones con agua (Vaerewijck et últimas décadas, el foco en investigación se ha realiza- al., 2014) durante el establecimiento y multiplicación do sobre la toxicidad, contaminación industrial, en in vitro de plántulas de piña de la variedad MD-2 Gol- agricultura buscando soluciones de bajo costo (Yagub den obtenidos de cuatro subcultivos consecutivos, de et al., 2014); se han buscado interacciones con el oxí- acuerdo a la recomendación los últimos estudios para geno, fibra asociada a la radiación plasma (Hassan y eliminar concentración de patógenos en vegetales Carr, 2019), así mismo, se ha visto interesantes efectos (Niemira y Fan, 2014). Los resultados sugieren que de los agentes contaminantes en membranas naturales pequeñas concentraciones de hipoclorito de sodio y (Liu et al., 2011). Tratamientos basados en bio com- ozono inhibe el crecimiento de contaminantes al inte- puestos para el tratamiento de la contaminación en rior de contenedores utilizados en biorreactores de frutas, tienen limitaciones en la propagación de enfer- inmersión temporal de una manera dosis dependiente. medades por el alto costo (Liu et al., 2017). La presen- cia de agentes contaminantes afecta el normal desarro- II. MATERIALES Y MÉTODOS llo de los explantes establecidos a condiciones in vitro El estudio se realizó en el Laboratorio de Biotecnolo- haciendo indispensable el uso de metodologías que gía Vegetal de la Estación Experimental Agraria “El permitan su eliminación (Goodburn y Wallace, 2013), Porvenir” - San Martín del Instituto Nacional de Inno- así como el uso de nano celulosa y nano fibrillas vación Agraria – INIA, ubicado en el Distrito de Juan celulosas para su eliminación (Kumar et al., 2019), por Guerra, San Martín, Perú. otro lado en los últimos años el uso de irradiación, alta Material vegetal temperatura e hibridación han sido métodos emplea- Brotes axilares de piña de la variedad MD-2 Golden dos para el mismo fin (Law et al., 2014). El uso de fueron extraídos de plantas maduras identificadas en agentes oxidantes como hipoclorito de sodio (NaOCl), parcelas de agricultores de la provincia de Moyobam- hipoclorito de mercurio (HgCl2) y ozono (O3) han sido ba, departamento de San Martín. Estos brotes fueron empleados en inúmeros trabajos con fines experimen- sumergidos en una solución fungicida-insecticida tales y/o industriales utilizando recipientes menores a (1g/L de Benomyl + 1mL/L de alphacypermetrina) por 2 Rev. de investig. agroproducción sustentable 4(1): 1-7, 2020 ISSN: 2520-9760 Control microbiano biorreactoes inmersión temporal Delgado H 15 minutos y expuestos bajo sombra para su secado enriquecidos con vitaminas y reguladores de creci- por un lapso de 5 días, luego de este tratamiento los miento para cada etapa. Diferenciación: Thiamine- brotes fueron llevados al laboratorio para un posterior HCl 0,4 mg/L + ácido nicotínico 0,5 mg/L + 6-bencil tratamiento. Estos brotes fueron cortados en dos partes amino purina (BAP) 3 mg/L + 10% (v/v) de endosper- (superficial y basal) a fin de quedarse con la región mo líquido de coco + sacarosa 30 g/L. Multiplicación: intermedia donde se concentra la región del cormo con Thiamine-HCl 0,4 mg/L + ácido nicotínico 0,5 mg/l + yemas no diferenciadas. La región intermedia fue 6-bencil amino purina (BAP) 2 mg/L + ácido naftalen lavada en constante agitación con agua y detergente acético (ANA) 0,3mg/L + sacarosa 30 g/L. Ambos por un intermedio de 10 minutos. Enseguida esta medios de cultivo fueron llevados a un pH de 5,8. Las región intermedia fue tratada con 2 mL/L de Kasumin condiciones de crecimiento para las dos etapas (dife- (kasugamicina) por 20 minutos y luego lavadas para renciación y multiplicación) fue a una temperatura de retirar las brácteas y exponer el cormo. El cormo resul- 24 ± 2 ºC, fotoperiodo de 16/8 e intensidad luminosa tante fue lavado y nuevamente tratado con 2mL/L de de 800 lux. A diferencia de la etapa de multiplicación, Kasumin por un intervalo de 10 minutos con menor las yemas que inician el proceso de diferenciación frecuencia de agitación a fin de evitar un daño sobre las fueron expuestas inicialmente a una condición de yemas axilares expuestas. Luego de este tratamiento el oscuridad total por 48 horas. cormo fue lavado por dos veces y llevado a desinfec- Desinfección de contenedores ción en la cámara de flujo laminar. El trabajo de desin- Los contenedores destinados a alojar medio de cultivo fección fue llevado por dos tiempos, el primero consis- y plántulas fueron lavados con agua jabonosa (solu- tió en colocar el cormo en una solución de 1% de hipo- ción de detergente 5g/L de agua) y enjuagados con clorito de sodio por un intervalo de 20 minutos en agua no destilada y agua destilada. Después de su constante agitación y luego enjuagados por tres perio- secado, fueron sometidos a diferentes tratamientos de dos de 1 minuto con agua destilada estéril. Luego, pequeñas concentraciones de agentes antimicrobianos fueron extraídas las yemas axilares con una buena como hipoclorito de sodio: 0%; 0,025%; 0,05% y proporción del tejido basal (cormo), estas yemas axila- 0,075% y la inyección de ozono: 0; 50; 100; 150 y 200 res fueron nuevamente tratadas con 0,5% de hipoclori- mg. Todos estos agentes antimicrobianos fueron apli- to de sodio por un intervalo de 5 minutos y posterior- cados al interior de los contenedores por 5 min para el mente enjuagados por tres periodos con agua destilada hipoclorito de sodio y 7,5; 15; 22,5 y 30 min para 50, estéril. Finalmente, fue eliminado el tejido basal afec- 100, 150 y 200 mg de ozono. Después de este trata- tado por el desinfectante y las yemas fueron inocula- miento los recipientes fueron expuestos por 30 minu- das en un medio de cultivo líquido en agitación (65 tos en el interior de las cámaras de flujo laminar con el rpm) para su diferenciación. La diferenciación y mul- objeto de volatilizar los restos del hipoclorito de sodio tiplicación de estas yemas durante cuatro subcultivos y el ozono aplicados. por 8 meses permitió obtener plántulas y clusters ópti- Sistema de inmersión temporal (multiplicación) mos para ser multiplicadas en un biorreactor de siste- Explantes (plántulas) que fueron acondicionados en ma de inmersión temporal. contenedores para multiplicación recibieron una pro- Condiciones de cultivo gramación de inmersión de cuatro minutos por fre- Para la diferenciación de yemas y multiplicación de cuencias repetidas de cuatro horas. El sistema estuvo brotes fueron empleados medios de cultivo líquido constituido por dos recipientes de plástico de 4 litros compuesto por sales minerales, en concreto el medio cada uno (un contenedor de medio de cultivo y otro Murashige & Skoog, a media concentración (diferen- contenedor de plántulas), los dos recipientes conecta- ciación) y concentración completa (multiplicación) dos por una manguera de plástico flexible constituyen Rev. de investig. agroproducción sustentable 4(1): 1-7, 2020 ISSN: 2520-9760 3 Control microbiano biorreactoes inmersión temporal Delgado H una unidad experimental. El flujo de aire generado por vo compuesta por un biorreactor (contenedor de medio un compresor fue microfiltrado (filtros de venteo de de cultivo, contenedor de explante y conexiones). Los 0,2 µm) y conducido al interior del contenedor del datos obtenidos fueron trabajados en Excel y llevando a medio de cultivo que mediante presión interna hizo la construcción de gráfico de barras, “en comparación posible la transferencia del medio de cultivo hacia el de una proporción con la proporción teórica de 0.50 que segundo recipiente de explantes. Terminada la inmer- representaría la mediana” (Parker y Vannest, 2009). sión, el flujo de aire fue invertido y por consiguiente una transferencia del medio hacia su contenedor origi- III. RESULTADOS Y DISCUSION nal. El tiempo y frecuencia de inmersión fue controla- Obtención de plántulas de piña (Ananas comosus do por un temporizador digital. Merr) Cv. MD2 vía organogénesis Diseño y análisis estadístico Para el empleo de sistemas de inmersión temporal que Fue empleado un diseño estadístico completamente al persigan fines de maximización en la multiplicación azar (DCA) (Sanz y Vera, 2015), compuesto por cuatro de plantas, es necesario contar con explantes iniciales. tratamientos para el experimento de hipoclorito de Basada en esta premisa fueron colectados brotes de sodio y cinco tratamientos para el experimento de ozono piña (Figura 1A), exponiendo el cormo libre de brac- (Castro, 2014). Ambos experimentos tuvieron un total teas (Figura 1B) y la individualización de yemas axila- de cuatro repeticiones. Cada unidad experimental estu- res (Figura 1C). A B C Figura 1. Yemas axilares obtenidas a partir de brotes de piña (Ananas comosus) Cult. MD2. A, Brote. B, Cormo. C, Yema axilar (explante). Escala 1 cm. Las yemas incubadas individualmente en medio de sobre condiciones in vitro. Esta diferenciación es cultivo después de un procedimiento de desinfección conocida como morfogénesis, documentada en consiguieron diferenciarse en plántulas y clusters muchas especies vegetales y valorada como una for- individuales por periodos de 40 a 70 días respectiva- mación discreta de órganos o plantas enteras, muy mente (Figura 2A, 2B), un tiempo óptimo para obtener empleada para estudios básicos en botánica, bioquími- plántulas individuales (Fig 2C), apropiadas para ini- ca, propagación, mejoramiento y desarrollo de culti- ciar su multiplicación en un biorreactor de sistema de vos transgénicos (Phillips, 2004). inmersión temporal. Utilización de ozono en recipientes de bioreactores La diferenciación de yemas axilares de piña ha sido de sistema de inmersión temporal hasta ahora la única vía satisfactoria para la multiplica- El establecimiento in vitro de explantes, está asociado ción de plantas dentro del grupo de las bromeliáceas la inocuidad del explante al método adecuado para la (Be y Debergh, 2006; Mhatre, 2007). Un resultado que esterilización de recipientes, medio de cultivo y mate- también ha sido evidenciado en esta investigación riales que son empleados durante los procedimientos 4 Rev. de investig. agroproducción sustentable 4(1): 1-7, 2020 ISSN: 2520-9760 Control microbiano biorreactoes inmersión temporal Delgado H A B C Figura 2. Individualización de plántulas de piña a partir de clusters unificados. A, Cluster de piña mantenidos en envases de polipropileno. B, Cluster de plántulas de piña. C, Plántula de piña utilizada para la multiplicación en BITs. Escala 1 cm. realizados. Se sabe que el método más empleado para Utilización de hipoclorito de sodio en recipientes de la esterilización de recipientes de biorreactores es bioreactores de sistema de inmersión temporal realizado a vapor con una presión de 1 atm (autoclava- Además de la utilización de ozono para inhibir el desa- do). Sin embargo, este método tiene una limitación en rrollo de microorganismos, hubo interés en si concen- cuanto al tamaño de los recipientes y el material con traciones menores al 1% de hipoclorito de sodio, los que son fabricados (vidrio, polietileno, policarbo- podrían tener un efecto inhibitorio en el desarrollo de nato, etc). Sobre este escenario se realizó pruebas de microorganismos contaminantes. Los resultados inyección de ozono dentro de recipientes de polietile- demuestran que concentraciones superiores a 0,025% no a diferentes concentraciones en mg, evaluándose la de cloro activo inhibe el desarrollo de microrganismos contaminación a posteriori por hasta 28 días. Los contaminantes para recipientes de polietileno usados resultados sugieren que concentraciones superiores a en biorreactores de sistemas de inmersión temporal, los 50 mg de ozono, inhibe el desarrollo de microorga- teniendo una inhibición total cuando se emplea nismos contaminantes. A partir de los 100 mg de 0,075% de hipoclorito de sodio. La usencia de hipo- ozono inyectado, la inhibición de crecimiento de clorito promueve el desarrollo de microorganimos microrganismos es absoluta. Contrariamente, la hasta un 100% 21 días después de su acondiciona- ausencia del ozono favorece su desarrollo en el tiem- miento (Figura 4). po, registrándose una contaminación del 25%, 50% y 75% a los 7, 14, 21 y 28 días después de su estableci- miento (Figura 3). Figura 4. Efecto de diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio (NaClO) en la desinfección de recipientes BITs. Evaluación de % de contaminación realizados a los 7, 14, 21 y 28 días después de su inoculación de explantes. Barras con diferentes colores muestran diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio (%). Figura 3. Efecto de diferentes concentraciones de ozono (O3) en la desinfección de recipientes BITs. Evaluación de % de El empleo de 100 mg de ozono o 0,075% de cloro contaminación realizados a los 7, 14, 21 y 28 días después de su inoculación de explantes. Barras con diferentes activo, inhibe al 100% el crecimiento de microorga- colores muestran diferentes concentraciones de ozono (mg). nismos contaminantes. Este resultado puede ser Rev. de investig. agroproducción sustentable 4(1): 1-7, 2020 ISSN: 2520-9760 5 Control microbiano biorreactoes inmersión temporal Delgado H empleado dentro de un proceso de micropropagación comosus). ” South African Journal of Botany in vitro que utilice contenedores mayores a 5L. 72 (2): 191-194. El éxito para el establecimiento in vitro de explantes, Cardarelli, M., y C. M. 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Massachusetts (EE.UU.): componentes resulta ser muy importante para la Academic Press micropropagación, tal es así que pequeñas concentra- Goodburn, C., y C. A. Wallace. 2013. “The microbio- ciones de los dos agentes oxidantes estudiados (hipo- logical efficacy of decontamination method- clorito al 0,075% y ozono 100 mg), tienen la capacidad ologies for fresh produce: A review.” Food de poder inhibir el crecimiento de microorganismos Control 32 (2): 418-427 contaminantes. Su incremento por ejemplo en un 1% - Hassan, M. M., y C. M. Carr. 2019. “A review of the 2% hipoclorito de sodio, puede generar el quemado sustainable methods in imparting shrink resis- del tejido (Silva et al., 2015; Yildiz & Er, 2002), por lo tance to wool fabrics.” Journal of Advanced que es necesario su remoción mediante numerosos Research 18. 39-60. enjuagues consecutivos. Contrariamente al hipoclori- Kim, J. G., A. Yousef, y M. A Khadre. 2003. “Ozone to de sodio, si hubiese un exceso de ozono puede ser and its current and future application in the removido con mayor facilidad por ser un gas. Final- food industry.” Advances in Food and Nutri- mente, la exposición de estos compuestos en elevadas tion Research 45: 167-218 concentraciones y por periodos largos puede acarrear a Kumar, V., P. Pathak, y N. K. Bhardwaj. 2019. “Waste un stress fisiológico que conlleva a la producción de paper: An underutilized but promising source etileno y maduración de órganos (Cardarelli y Cardo- for nanocellulose mining.” Waste Manage- na, 2017), una característica fisiológica que no fue ment 102 (1): 281-303. evidenciada en el estudio. Law, C. L., Chen, H. H. H., y Mujumdar A. S. 2014. “Food Technologies: Drying”. En Encyclope- IV. CONCLUSIONES dia of Food Safety. Motarjemi, Y., G. Moy, E. El empleo de bajas concentraciones superiores a 100 Todd (eds). Massachusetts (EE.UU.): Acade- mg ozono y 0,075% de hipoclorito de sodio, inhibe mic Press satisfactoriamente el crecimiento de contaminantes Liu, F., N. A. Hashim, Y. Liu, M. R. Moghareh Abed, y microbianos al interior de recipientes de polietileno K. Li. 2011. “Progress in the production and frágiles a recibir elevadas temperaturas (autoclavado). modification of PVDF membranes.” Journal of Membrane Science 375 (1–2): 1-27. V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Liu, M., A. Thygesen, J. Summerscales, y A. S. Meyer. Be, L. V., y P. C. Debergh. 2006. “Potential low-cost 2017. “Targeted pre-treatment of hemp bast micropropagation of pineapple (Ananas fi b r e s f o r o p t i m a l p e r f o r m a n c e i n 6 Rev. de investig. agroproducción sustentable 4(1): 1-7, 2020 ISSN: 2520-9760 Control microbiano biorreactoes inmersión temporal Delgado H biocomposite materials: A review.” Indus- Caballero, B., L. Trugo, y P. M. Finglas (eds). trial Crops and Products 108: 660-683. 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