MINISTERIO DE AGRICULTURA Y RIEGO INSTITUTO NACIONAL DE INNOVACIÓN AGRARIA DIRECCIÓN DE RECURSOS GENÉTICOS Y BIOTECNOLOGÍA Manual de Conservación Proyecto PNIA 082_PI “Conservación y análisis de diversidad genética de la oca (Oxalis tuberosa) en el Perú” Manual de conservación in vitro en el Banco de Germoplasma del INIA Tabla de Ministerio de Agricultura y Riego Editor general: CONTENIDO Eliana Alviárez Gutierrez, M.Sc. Ministro de Agricultura y Riego Ing. Jorge Luis Montenegro Chavesta Revisión de contenido: Presentación ..........................................................................................................5 Gabriela Salazar Alvarez Viceministro de Desarrollo e Infraestructura Agraria y Riego Betty Flores Gonzales 1. Introducción al cultivo de tejidos in vitro ............................................................................7 Econ. Carlos Alberto Ynga La Plata Heillen Calderón Castillo 1.1. Importancia del cultivo de tejidos para la conservación in vitro de recursos genéticos ..................................7 Viceministra de Políticas Agrarias Diseño y diagramación: 1.2. Etapas de la regeneración de plantas in vitro en el banco de germoplasma del INIA ....................................... 8 Econ. Paula Rosa Carrión Tello Abner Fernando Mio Torrejón Luis Carlos Arévalo Mercado 1.3. Conservación in vitro a corto plazo en el banco de germoplasma del INIA .......................................................9 Jefe del INIA Jeams López Acaro 1.4. Conservación in vitro a mediano plazo en el banco de germoplasma del INIA .............................................. 11 Jorge Luis Maicelo Quintana, Ph. D. Publicado: 2. Monitoreo de viabilidad en el banco de germoplasma del INIA ........................................12 © Instituto Nacional de Innovación Agraria-INIA Diciembre, 2019 Primera edición: 2.1. Evaluación de Viabilidad .................................................................................................................................... 12 Autores: Diciembre, 2019 Elizabeth Fernandez Tiraje: 2.1.1. Estado de la Accesión .............................................................................................................................12 Cinthya Zorrilla 150 ejemplares 2.1.2. Estado de la planta ............................................................................................................................... 12 Anait García 2.1.2.1. Necrosis ............................................................................................................................................. 13 Carlos A. Amasifuen Guerra Impreso en: 2.1.2.2. Defoliación ......................................................................................................................................... 13 Nombre de la imprenta: Chimac SAC 2.1.2.3. Enraizamiento .................................................................................................................................... 13 Revisor de contenido: RUC: 20554037756 2.1.2.4. Fenolización ........................................................................................................................................13 Flor Rodríguez Teléfono: 01 3260981 2.1.2.5. Clorosis .............................................................................................................................................. 14 Dirección: Av Prolong. Mariscal Nieto Nro 229 Urb. Los Sauces - Fotografía: Ate - Lima 2.1.2.6. Vitrificación ........................................................................................................................................ 14 Olegario Robles E-mail: esotot@chimac.com.pe / proyectos@chimac.com.pe Anait García 3. Evaluación del estado fitosanitario ................................................................................. 18 Elizabeth Fernandez ISBN: 978-9972-44-039-7 Editado por: 4. Formulaciones para las preparaciones de medios de cultivo ............................................ 19 Instituto Nacional de Innovación Agraria - INIA Equipo Técnico de Edición y Publicaciones 4.1. Oca: Medio de Conservación a Corto Plazo (OCP) y Medio de Conservación a Mediano Plazo (OMP) ....... 19 Av. La Molina 1981, Lima- Perú 4.2. Ulluco: Medio de Conservación a Corto Plazo (UCP) y Medio de Conservación a Mediano Plazo (UMP) .... 21 (51 1) 240-2100 / 240-2350 4.3. Mashua: Medio de Conservación a Corto Plazo (MCP) ................................................................................... 23 www.inia.gob.pe 4.4. Yacón: Medio de Conservación a Corto Plazo (YCP) ......................................................................................... 25 4.5. Tomate de árbol: Medio de Conservación a Corto Plazo (TACP) ..................................................................... 26 5. Procedimientos para la identificación de microorganismos contaminadores ................... 28 5.1. Microorganismos más comunes en el cultivo de tejidos in vitro ................................................................... 28 6. Procedimientos adicionales ............................................................................................. 30 6.1. Desinfección de cámara de flujo laminar y herramientas para el cultivo in vitro .......................................... 30 6.2. Procedimiento para realizar subcultivo de material vegetal .......................................................................... 30 6.3. Lavado de material de vidrio con plántulas in vitro no contaminadas y contaminadas ................................ 32 6.4. Descarte de material contaminado con microorganismos ............................................................................. 32 6.5. Limpieza y desinfección de los cuartos de incubación y conservación del banco in vitro ............................. 33 6.6. Tratamiento de explantes contaminados con bacterias ................................................................................. 33 7. Referencias ..................................................................................................................... 35 Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú N° 2019-18755 Prohibida la reproducción de este libro por cualquier medio, total o parcialmente, sin permiso expreso. PRESENTACIÓN L a conservación de germoplasma en condiciones in vitro es de gran utilidad en la preservación de especies vegetales que se propagan vegetativamente y que tienen ciclos de vida largos y/o producen semillas no ortodoxas. Esta estrategia permite el manejo de manera costo-efectiva, en comparación con la conservación en campo, ofreciendo ventajas adicionales para la distribución de germoplasma en términos de disponibilidad y sanidad. El Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA) posee una colección de germoplasma in vitro, la cual se viene fortaleciendo e incrementando en cuanto al número de accesiones que conserva. Las formulaciones y procedimientos estandarizados que se han establecido se presentan en este documento de manera que puedan ser de conocimiento de la comunidad científica. Aún existen múltiples temas de investigación para optimizar la conservación del germoplasma en condiciones in vitro y este manual, pretende motivar a los investigadores a adoptar esta línea de investigación. 5 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA 1. Introducción al cultivo de tejidos in vitro El cultivo in vitro es una técnica que se basa en el aislamiento de órganos, tejidos o células vegetales en condiciones asépticas, en un medio de composición química determinado e incubados en condiciones controladas (Roca y Mroginski, 1991). A partir de la micropropagación de explantes (tallos, hojas, raíces y/o yemas axilares), de una única planta, se puede conseguir un gran número de plántulas debido al principio de totipotencia, capacidad que tiene una célula de regenerar una planta completa (Muñoz, 2006). Por ello, las plantas que resultan de la propagación asexual o vegetativa, son idénticas a la planta madre e idénticas entre sí, es decir que son clones (Figura 1). Con algunas plantas, es posible culvar segmentos de tallo que consisten en múlples nudos Etapa I Subculvo Brotes segmentados para subculvo Corte de hojas y corte diagonal de tallo en Etapa I Etapa II Etapa III segmentos de nudos simples o múlples Culvo de Crecimiento Brotes individuales nudos simples del brote a parr enraizados o dobles de yemas axilares (de ser necesario) Figura 1. Micropropagación vegetal. George, Hall and Jan De Klerk (2008). 1.1. Importancia del cultivo de tejidos para la conservación in vitro de recursos genéticos Los recursos fitogenéticos son la base de la seguridad alimentaria mundial, por tal motivo, es de gran importancia conservar y mantener la diversidad genética de las especies silvestres, cultivares locales tradicionales y variedades mejoradas (Sánchez-Chiang y Jiménez, 2010). Una de las formas de conservarlas es haciendo uso del cultivo de tejidos vegetales, que permite el crecimiento y desarrollo del material vegetal en recipientes que los separan del ambiente y los mantienen en condiciones controladas y asépticas, garantizando la sanidad del material. El cultivo de tejidos vegetales in vitro ofrece la posibilidad de almacenar un elevado número y variedad de muestras en un área reducida, facilitando su acceso para la evaluación y el estudio (Rao, 2004). La conservación in vitro es parte de la estrategia de conservación de los recursos fitogenéticos que se realiza en los Bancos de Germoplasma. 7 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA Esta técnica tiene múltiples ventajas: los nutrientes esenciales para el crecimiento y el medio de soporte. Sus componentes principales son básicamente agua, sales minerales y la fuente de carbono (azúcares). Además, se utilizan • Permite sanear plantas con virus, mediante el cultivo de meristemos y termoterapia. vitaminas, reguladores del crecimiento y agentes gelificantes como el agar (Sharry et al., 2015). • Las plántulas se mantienen libres de plagas y enfermedades, por ser una técnica que requiere Si bien la proporción de sus componentes depende de cada especie, la formulación base más de mucha asepsia. utilizada fue propuesta por Murashige y Skoog (1962), que tiene agar como medio de soporte. En esta etapa generalmente se emplean los reguladores de crecimiento como citoquininas y el • Facilita la elaboración de una propagación clonal masiva de plantas idénticas en un corto tiem- ácido giberélico. Los tubos de cultivo con el material vegetal, son transferidos a una cámara de po, en cualquier época del año. crecimiento en las condiciones climáticas de acuerdo al habitat de la especie. • El costo de la conservación in vitro es mucho menor que la conservación en campo. Evita el riesgo de pérdidas por factores climáticos (presencia de heladas, sequías prolongadas, granizadas o c) Etapa 3: enraizamiento y elongación temperaturas elevadas) y disminuye el riesgo de pérdidas debido a factores bióticos. En esta etapa se induce al desarrollo del sistema radicular y como consecuencia la elongación • Permite realizar un tamizado para estrés biótico y abiótico a un alto número de muestras bajo del explante. Para el enraizamiento pueden emplearse varios tipos de sustratos como medio condiciones controladas. solidificado, tales como agar (6 g/L – 8 g/L) o almidón (8 g/L) en adecuadas concentraciones (Sharry et al., 2015). Para promover la rizogénesis, se utilizan hormonas del tipo auxinas, como • Admite la distribución segura de germoplasma libre de patógenos cuarentenarios. por ejemplo el ácido indolacético (AIA), que es la única auxina natural que se localiza en las zonas de crecimiento, también se utiliza el ácido naftalenacético (ANA), que es una auxina 1.2. Etapas de la regeneración de plantas in vitro en el banco de germoplasma del INIA sintetizada químicamente. a) Etapa 1: establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia La elongación o alargamiento consiste en el crecimiento y desarrollo de brotes vigorosos debido a la división celular, el cual es estimulado por la presencia de citoquininas. Dentro de El objetivo de esta etapa es establecer cultivos viables y asépticos. El éxito de esta etapa está las citoquininas naturales se encuentra la zeatina (ZEA), mientras que dentro de las citoquininas determinado por la edad de la planta madre, la edad fisiológica, el estado de desarrollo y el sintéticas, están la bencilaminopurina (6 BAP) y la kinetina (KIN). El establecimiento in vitro tamaño del explante. Los principales procesos a controlar son: la selección, el aislamiento y comprende el enraizamiento, elongación y desarrollo del explante, así como la ausencia de la esterilización de los explantes (Sánchez-Chiang y Jiménez, 2010). Los materiales vegetales microorganismos contaminantes (George et al., 2008). que demuestran tener mayor capacidad regenerativa son obtenidos de tejidos meristemáticos jóvenes, sean yemas axilares o adventicias. Esta etapa se inicia con la desinfección superficial 1.3. Conservación in vitro a corto plazo en el banco de germoplasma del INIA del explante con varios lavados con etanol (70 %) o hipoclorito de sodio (0.5 % – 2 %) durante 3 minutos a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante; seguido de lavados con agua En este tipo de conservación, los explantes permanecen viables en el cultivo in vitro por un máximo destilada estéril (Ramos, 2012). El lavado previo de los explantes, realizado con agua corriente, de 6 meses (Bonilla, Mancipe y Aguirre, 2015). El INIA tiene implementados y establecidos medios detergentes y un agente tensoactivo Tween - 20 (0.01 % – 0.1 %), ayuda a obtener una mejor de cultivo para fines de conservación a corto plazo para Tropaelum tuberosum (mashua), Manihot desinfección (Sharry, Adema y Abedini, 2015). Después de la desinfección superficial, se retiran esculenta (yuca), Smallanthus sonchifolius (yacón), Cyphomandra betacea (tomate de árbol), las partes oxidadas de cada explante y se cortan segmentos nodales, dejando solo una yema con Ullucus tuberosa (ulluco) y Oxalis tuberosa (oca). Las condiciones de conservación son mostradas alguna porción del tallo. Cada entrenudo es colocado en un tubo de cultivo (150 mm x 25 mm) en la tabla 1. El material vegetal con el que se inicia este tipo de conservación, proviene de plántulas que contiene 10 mL de medio de cultivo base MS (Murashige y Skoog) u otro, dependiendo del vigorosas, introducidas a cultivo in vitro. cultivo. Los tubos de cultivo con el material vegetal son transferidos a una cámara de crecimiento con 21 °C y fotoperiodo 16:08 (luz:oscuridad). Durante su permanencia se realizan evaluaciones periódicas a los explantes sembrados. b) Etapa 2: multiplicación El objetivo de esta etapa es mantener e incrementar el número de brotes para los nuevos ciclos de multiplicación, esta actividad es también denominada subcultivo. Para ello, se realizan cortes en diagonal, entre nudo y nudo, para aislar las yemas principales de modo que este tipo de explante mantenga la fidelidad genética de la planta madre a lo largo de todo el proceso de micropropagación. El medio de cultivo tiene un papel fundamental debido a que brinda todos 8 9 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA Tabla 1 1.4. Conservación in vitro a mediano plazo en el banco de germoplasma del INIA Cultivos y condiciones in vitro a corto plazo En este tipo de conservación, los explantes permanecen viables por más de 6 meses en cultivo in Cultivo Parámetros Corto plazo vitro. Para lograr el objetivo de disminuir la tasa de crecimiento de los explantes y aumentar los Temperatura 15 °C intervalos entre subcultivos, se emplea una serie de estrategias: reducir la temperatura de los N° de tubos 6 cuartos de crecimiento y modificar la composición de los medios de cultivo. La disminución de la N° de plántulas/tubo 1 temperatura produce una reducción en la actividad metabólica y en consecuencia, en el crecimiento Yacón de los explantes (esta temperatura depende de los requerimientos de cada especie). La modificación Unidad de conservación (plántula) 6 de la composición del medio de cultivo, así como la adición de agentes osmóticos (sucrosa, sorbitol Tiempo máximo de permanencia 4 o manitol en concentraciones elevadas), o el uso de concentraciones mayores de gelificantes (agar), (meses) reducen la absorción de nutrientes por los explantes y por tanto, se retarda el crecimiento (Bonilla Temperatura 21 °C et al., 2015). N° de tubos 4 El INIA tiene implementado y optimizado medios de cultivo para fines de conservación a mediano Yuca N° de plántulas/tubo 3 plazo de Ullucus tuberosa (ulluco) y Oxalis tuberosa (oca) (ver capítulo V) y sus condiciones de con- Unidad de conservación (plántula) 12 servación son mostradas en la tabla 2. Tiempo máximo de permanencia (meses) 5 Cabe mencionar, que el material vegetal para dar inicio a la conservación a mediano plazo, siempre Temperatura 15 °C debe provenir de plántulas madre que se encuentran en medios de conservación a corto plazo, con la finalidad de desestresar las plántulas y contar con explantes de mayor vigor. N° de tubos 6 Tomate de árbol N° de plántulas/tubo 1 Tabla 2 Unidad de conservación (plántula) 6 Cultivos y condiciones in vitro a mediano plazo Tiempo máximo de permanencia (meses) 3 Cultivo Parámetros Corto plazo Temperatura 15 °C Temperatura 15 °C N° de tubos 3 N° de tubos 4 N° de plántulas/tubo 4 Ulluco N° de plántulas/tubo 4Mashua Unidad de conservación (plántula) 12 Unidad de conservación (plántulas) 16 Tiempo máximo de permanencias Tiempo máximo de permanencia 12 (meses) 5 (meses) Temperatura 21 °C Temperatura 15 °C N° de tubos 2 N° de tubos 4 N° de plántulas/tubo 4 Oca N° de plántulas/tubo 4Ulluco Unidad de conservación (plántula) 8 Unidad de conservación (plántulas) 16 Tiempo máximo de permanencia Tiempo máximo de permanencia 6 (meses) 1 (meses) Temperatura 21 °C Fotoperiodo de 16:08 (luz/oscuridad) con lámparas fluorescentes intensidad de 3 000 Lux. N° de tubos 2 Oca N° de plántulas/tubo 4 Unidad de conservación (plántula) 8 Tiempo máximo de permanencia (meses) 1 Fotoperiodo de 16:08 (luz/oscuridad) con lámparas fluorescentes intensidad de 3 000 Lux. 10 11 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA 2. Monitoreo de viabilidad en el banco Tabla 4Indicadores usados en la evaluación visual de viabilidad de germoplasma del INIA Necrosis (%) Defoliación (%) Enraizamiento Fenolización Clorosis (%) Vitrificación (%) Bueno (0 – 10 ) Bueno (0 – 10 ) Bueno Ausente Ausente (0 – 10 ) Ausente Para asegurar la viabilidad de los subcultivos se debe realizar evaluaciones periódicas y sistemáticas, las Medio (10 – 40 ) Medio (10 - 40 ) Medio Leve Leve (10 – 40 ) Leve (6 – 40 ) cuales además deben ser documentadas. Existen dos tipos de evaluaciones que se realizan rutinariamente, estos incluyen: evaluaciones de la viabilidad (verificación del estado fisiológico de los explantes) y la Regular (40 – 70 ) Regular (40 – 70 ) Escaso Media Media (40 – 70 ) Media (40 – 70 ) evaluación del estado fitosanitario de los explantes subcultivados (contaminación microbiana). Malo (70 – 100 ) Malo (70 – 100 ) Malo Alta Alta (70 – 100 ) Alta (70 – 100 ) 2.1. Evaluación de viabilidad 2.1.2.1. Necrosis En esta evaluación se revisa el normal crecimiento de las plántulas, así como la presencia de hojas, Son lesiones oscuras que aparecen en la yema y tallo debido a la presencia de células muertas, tallos y raíces en buen estado. La evaluación de la viabilidad se realiza en forma visual por lote así como por la oxidación de compuestos fenólicos, catalizados por la enzima polifenol oxidasa (número total de tubos por accesión) o por planta, utilizando los descriptores de las tablas 3 y 4 para producir quinonas, las cuales son especies químicas muy reactivas y propensas a reaccionar respectivamente. La primera evaluación de viabilidad se realiza a los 5 días y 25 días. El seguimiento generando daño e incluso la muerte celular (se visualiza la oxidación u oscurecimiento de los a la viabilidad de los explantes se realiza mensualmente, para determinar el estado de atención, tejidos) (Figura 2) (Bray, Bailey-Serre y Weretilnyk, 2000). para refrescar el material vegetal, antes de que se presente una total defoliación o zonas necróticas y/o muerte del explante. 2.1.1. Estado de la accesión La evaluación visual se realiza con la totalidad del número de tubos por accesión y es de acuerdo a la presencia de síntomas de deterioro fisiológico (senescencia) (Tabla 3). Tabla 3 Porcentaje asignado a cada estado de accesión Estado de la accesión * Porcentaje (%) Bueno 80 – 100 Medio 60 - 80 Regular 40 - 60 Malo Menor a 40 *Estado de la Accesión= Porcentaje de tubos buenos/total de tubos (%) 2.1.2. Estado de la planta Figura 2. Estadios del indicador necrosis en el cultivo de yacón de acuerdo Existen 6 indicadores o descriptores utilizados en la evaluación visual de viabilidad de los explantes a la tabla 4. Progresivo oscurecimiento en la base del tallo. De izquierda a subcultivados (Panta, Sánchez, Gonzales, Manrique, Barkley y Ellis, 2016). Se evalúa la viabilidad derecha: bueno, medio, regular y malo del explante de acuerdo a los niveles de los indicadores mostrados en la tabla 4. 12 13 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA 2.1.2.2. Defoliación Este descriptor mide el porcentaje de amarillamiento y caída de hojas. Este efecto es produ- cido por diversos factores como: enfermedades, agentes químicos o por falta de hierro en los medios de cultivo. Los cultivos deben renovarse antes de que presenten una total defoliación (Mafla, Roa, Aranzales y Debouck, 2010) (Figura 3). 2.1.2.3. Enraizamiento El proceso de enraizamiento es la capacidad del material vegetal de formar raíz en el medio de cultivo in vitro. La formación del sistema radical y el crecimiento de las raíces de los brotes propagados in vitro, tiene como objetivo producir plantas con buenas características fisiológicas y morfológicas para que puedan sobrevivir a condiciones de trasplante (Quintero, Polo, Jarma y Espitia, 2003) (Figura 4). 2.1.2.4. Fenolización La fenolización se refiere a la oxidación de compuestos fenólicos que son liberados por las células dañadas con el corte. Las extremidades cortadas se tornan oscuras rápidamente. Los productos de la oxidación son tóxicos para el resto del explante y se difunden en el medio de cultivo oscureciéndolo (Aguirre, Baudoin y Leigue, 2016), esto Figura 3. Diferentes estadios del indicador defoliación en el cultivo de debido a la excreción de sustancias como polifenoles y taninos (Villamizar, 2005). tomate de árbol. Desprendimiento progresivo de las hojas. De izquierda a derecha: bueno, medio y malo. 2.1.2.5. Clorosis Es una condición fisiológica anormal en la que el follaje produce insuficiente clorofila. Cuando esto ocurre, las hojas no tienen la coloración verde normal, presentan un color verde pálido, amarillo o amarillo blanquecino. Las plantas afectadas tienen disminuida la capacidad de formar carbohidratos y pueden morir si la causa de su insuficiencia clorofílica no es tratada. El exceso de calcio y/o deficiencias específicas de nutrientes (frecuentemente agravadas por un alto nivel de pH) también producen clorosis (Figura 6). El color amarillento en los cultivos nos indica que es necesario proceder a realizar el subcultivo y sembrar nuevamente en un medio de cultivo fresco (Mafla et al., 2010). 2.1.2.6. Vitrificación Es una principal anomalía asociada con la propagación in vitro de un gran número de especies (Casas y Lasa, 1986). Esta terminología se refiere a los desarreglos morfológicos y fisiológicos que se describen como cambios en las hojas, tallos y raíces que les dan una apariencia cristalina, acuosa, húmeda y translucida (Figura 7). Este problema va a impedir el normal establecimiento de plantas micropropagadas a condiciones ex vitro. Existen posibles causas de estas malformaciones, como elevadas dosis de reguladores de crecimiento, una baja luminosidad durante la incubación, la humedad relativa y al Figura 4. Estadios del indicador enraizamiento en el cultivo de yuca. De potencial hídrico. izquierda a derecha: bueno, medio, escaso y malo. 14 15 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA Figura 5. Estadios del indicador de fenolización en tomate de árbol conservado en condiciones in vitro. De izquierda a derecha: no, leve, alta. Figura 7. Plántula de Smallanthus sonchifolius (yacón) vitrificada. Estadio del indicador de vitrificación alto, nótese los cristales formados alrededor del tallo. Figura 6. Estado de clorosis para el cultivo de yuca en condiciones in vitro. De Izquierda a derecha: no, leve, media y alta. 16 17 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA 3. Evaluación del estado fitosanitario 4. Formulaciones para las preparaciones de medios de cultivo Una vez realizado los subcultivos, estos son ingresados al cuarto de conservación de 21 °C para su establecimiento y monitoreo fitosanitario. Esta temperatura permite el crecimiento de ciertos patógenos como hongos y bacterias. Se debe evaluar de forma visual a los 5, 15 y 25 días la aparición de Para el cultivo in vitro es fundamental definir los medios de cultivo adecuados, ya que son la base para el microorganismos, como se muestra en la figura 8. desarrollo de las plantas. El medio de cultivo es una solución acuosa que está formada por compuestos inorgánicos, compuestos orgánicos, complejos naturales, agentes de soporte y gelificación, requeridos para la nutrición. La composición del medio de cultivo depende de la necesidad de cada especie. El crecimiento y la diferenciación celular se controlan modificando la proporción entre hormonas y reguladores de Día 0 Día 5 Día 15 Día 25 crecimiento (Muñoz, 2006). Para el cultivo in vitro de plantas se ha utilizado el medio Murashige y Skoog (MS), desarrollado por los científicos Toshio Murashige y Folke K. Skoog en 1962, durante sus investigaciones Todos los tubos Evaluación Evaluación de nuevos reguladores del desarrollo vegetal usado en el cultivo in vitro de tejidos de tabaco. En el INIA se limpios de asepsia de asepsia utiliza el medio basal MS (no contiene fuente de carbono, hormonas vegetales, ni vitaminas), como fuente de carbono se utiliza la sucrosa y se agrega diferentes combinaciones hormonales de auxinas y citoquininas Descarta y destruir por dependiendo del cultivo. Las formulaciones de los medios de cultivo de RTA´s (Raíces Tuberosas Andinas) Subculvo Evaluación Algunos tubos esterilización, los Evaluación Evaluaciónde asepsia contaminados tubos limpios de asepsia de asepsia se elaboraron en base al manual “Conservación in vitro de raíces y tubérculos andinos, publicado por el siguen su Cuarto de crecimiento Centro Internacional de la papa” (Panta et al., 2016). crecimiento 21 °C Todos los tubos Procedimiento contaminados de desinfección 4.1. Oca: Medio de Conservación a Corto Plazo (OCP) y Medio de Conservación a Mediano Plazo (OMP) Materiales antes de la preparación del medio: Área de Cámaras Cuarto de Área de Cuarto de Cuarto de • Tubos de ensayo de 25 mm x 150 mm con sus respectivas tapas de polipropileno (verificar que de Flujo Laminar crecimiento crecimiento crecimiento21 °C lavado 21 °C 21 °C estos materiales se encuentren íntegros y sin rajaduras) • Gradillas para tubos de 25 mm x 150 mm Figura 8. Flujograma de la evaluación y monitoreo del estado fitosanitario. • Vaso de precipitado de 2 L La primera evaluación fitosanitaria (a los 5 días) tiene como objetivo la detección de signos de • Probeta de 1 mL crecimiento microbiano en todos los clones (réplicas) de una accesión. Se evalúa la presencia de hongos, bacterias o ambas. Si se encontrara algún tubo contaminado se debe realizar el descarte del material, • Jeringas de 1 mL, 5 mL y 10 mL esterilización en autoclave y repetir el proceso de subcultivo; si la accesión contaminada es única, realizar • Micropipeta de 1 mL y puntas estériles los procedimientos para desinfección y limpieza del material vegetal. Caso contrario, si el explante está visiblemente limpio, este sigue su crecimiento hasta realizar las siguientes evaluaciones fitosanitarias a • Magnetos los 15 y 25 días. Se recomienda realizar una supervisión cada 30 días. • Pipetas Pasteur • Bandejas de poliestireno para pesar • pH-metro • Balanza • Soluciones de NaOH (0.1 N) y HCl (0.1 N) 18 19 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA Preparación del medio de cultivo (1 L): Tabla 5 Concentración de los componentes para medios de oca (volumen final 1 L) 1. Antes de la preparación de los medios de cultivo es necesario disponer de materiales estériles y de recipientes dosificadores adecuados. Orden Componente OCP OMP 1 Sales MS 4.43 g 4.43 g 2. Medir 1 L de agua destilada en una probeta y transferir aproximadamente 700 mL en el vaso de precipitado. Colocar un magneto y ponerlo sobre el agitador magnético y encender. 2 Tiamina HCl 1 000 ppm 1 mL 1 mL 3 Myo-inositol 0.1 g 0.1 g 3. Utilizar una bandeja para pesar 4.43 g de la sal MS y agregarlo al vaso de precipitado (tabla 5). 4 Pantotenato de calcio 0.1 g 0.1 g 4. Utilizar una bandeja para pesar 20 g de sucrosa y agregarlo al vaso de precipitado. 5 AG3 100 ppm 0.25 mL --- 6 AIA 100 ppm 5 mL --- 5. Pesar 0.1 g de Myo-inositol y 0.1 g de pantotenato de calcio y transferirlos al vaso de precipitado. Con la ayuda de una micropipeta medir 1 mL de tiamina a 1 000 ppm, 0.25 mL de AG (ácido 7 Sorbitol --- 20 g3 giberélico) y agregarlo al vaso de precipitado. 8 Sucrosa 20 g 20 g 9 Agar 6.5 g 6.5 g 6. Con una jeringa de 5 mL de capacidad medir 5 mL de AIA (ácido indolacético) y agregarlo al vaso precipitado. pH= 5.7, esterilizar 7. Llevar a un volumen final de 1 L (con los 300 mL de agua destilada de la probeta). 4.2. Ulluco: Medio de Conservación a Corto Plazo (UCP) y Medio de Conservación a Mediano 8. Ajustar el pH a 5.7 con la ayuda de las soluciones de HCl (0.1 N) o NaOH (0.1 N). Plazo (UMP) 9. Añadir 6.5 g de agente gelificante (agar), agregar todo el contenido y asegurarse de hacerlo Materiales antes de la preparación del medio: muy cerca del vaso de precipitado pues el aire puede difuminar parte del contenido. • Tubos de ensayo de 20 mm x 150 mm con sus respectivas tapas de polipropileno (verificar que 10. Disolver el gelificante con ayuda del calor, para ello colocar el vaso de precipitado en el horno estos materiales se encuentren íntegros y sin rajaduras) microondas por aproximadamente 5 minutos. Una vez licuado el agar, usar guantes para sacarlo fuera del microondas. • Gradillas para tubos de 25 mm x 150 mm 11. Usando un dosificador, dispensar 10 mL del medio en los tubos, colocar las tapas, poner un • Vaso de precipitado de 2 L pedazo de cinta indicadora de autoclave y rotular adecuadamente poniendo el nombre del • Probeta de 1 mL medio de cultivo y la fecha de preparación. • Jeringas de 1 mL, 5 mL y 10 mL 12. Esterilizar en autoclave los tubos con medio de cultivo a 121 °C durante 15 minutos. • Micropipeta de 1 mL y puntas estériles 13. Dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente. • Magnetos 14. Guardar el material esterilizado a 4 °C hasta el momento de su uso. • Pipetas Pasteur • Bandejas de poliestireno para pesar • pH-metro • Balanza • Soluciones de NaOH (0.1 N) y HCl (0.1 N) 20 21 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA Preparación del medio de cultivo (1 L): Tabla 6 Concentración de los componentes en los medios para ulluco (volumen final 1 L) 1. Antes de la preparación de los medios de cultivo es necesario disponer de materiales estériles y de recipientes dosificadores adecuados. Componente UCP UMP 2. Medir 1 L de agua destilada en una probeta y transferir aproximadamente 700 mL en el vaso Sal MS 4.43 g 4.43 g de precipitado. Colocar un magneto y ponerlo sobre el agitador magnético y encender. Base RTA 1 mL 1 mL Pantotenato de calcio 2 000 3. Utilizar una bandeja de poliestireno para pesar 4.43 g de la sal MS y agregarlo al vaso de ppm 2 mL 2 mL precipitado (Tabla 6). AG3 100 ppm 0.25 mL --- 4. Pesar 20 g de sucrosa y agregarlo al vaso de precipitado. AIA 100 ppm 5 mL --- 5. Medir con la ayuda de una micropipeta 1 mL de Base RTA (Raíces Tuberosas Andinas), 0.25 mL Sorbitol --- 20 g de AG3 (ácido giberélico) y agregarlo al vaso de precipitado. Sucrosa 20 g 20 g Agar 6 g 6 g 6. Con una jeringa de 5 mL de capacidad medir 2 mL de pantotenato de calcio y 5 mL de AIA (áci- do indolacético) y agregarlo al vaso de precipitado. pH= 5.6, esterilizar 15. Llevar a volumen final de 1 L y ajustar el pH a 5.6 con la ayuda de soluciones de HCl (0.1 N) o NaOH (0.1 N). 4.3. Mashua: Medio de Conservación a Corto Plazo (MCP) 16. Añadir 6 g de agente gelificante (agar), agregar todo el contenido y asegurarse de hacerlo muy Materiales antes de la preparación del medio: cerca del vaso de precipitado, pues el aire puede difuminar parte del contenido. • Tubos de ensayo de 25 mm x 150 mm con sus respectivas tapas de polipropileno (verificar que 17. Disolver el gelificante con ayuda del calor, para ello colocar el vaso de precipitado en el horno estos materiales se encuentren íntegros y sin rajaduras) microondas aproximadamente 5 minutos. Una vez licuado el agar, usar guantes para sacarlo fuera del microondas. • Gradillas para tubos de 25 mm x 150 mm 18. Usando un dosificador, dispensar 6 mL del medio en los tubos, colocar las tapas, poner un pe- • Vaso de precipitado de 2 L dazo de cinta indicadora de autoclave y rotular adecuadamente poniendo el nombre del medio • Probeta de 1 mL de cultivo y la fecha de preparación. • Jeringas de 1 mL, 5 mL y 10 mL 19. Esterilizar en autoclave los tubos con medio de cultivo a 121 °C durante 15 minutos. • Micropipeta de 1 mL y puntas estériles 20. Dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente. • Magnetos 21. Guardar el material esterilizado a 4 °C hasta el momento de su uso. • Pipetas Pasteur • Bandejas de poliestireno para pesar • pH-metro • Balanza • Soluciones de NaOH (0.1 N) y HCl (0.1 N) 22 23 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA Preparación del medio de cultivo (1L): 4.4. Yacón: Medio de Conservación a Corto Plazo (YCP) 1. Antes de la preparación de los medios de cultivo es necesario disponer de materiales estériles Materiales antes de la preparación del medio: y de recipientes dosificadores adecuados. • Tubos de ensayo de 25 mm x 150 mm con sus respectivas tapas de polipropileno (verificar que 2. Medir 1 L de agua destilada en una probeta, y transferir aproximadamente 700 mL en el vaso estos materiales se encuentren íntegros y sin rajaduras) de precipitado. Colocar un magneto y ponerlo sobre el agitador magnético y encender. • Gradillas para tubos de 25 mm x 150 mm 3. Utilizar una bandeja para pesar 4.43 g de la sal MS y agregarlo al vaso de precipitado (Tabla 7). • Vaso de precipitado de 2 L 4. Utilizar una bandeja de poliestireno para pesar 20 g de sucrosa y agregarlo al vaso de precipitado. • Probeta de 1 mL 5. Medir con la ayuda de una micropipeta 1 mL de Base RTA (Raíces Tuberosas Andinas), 0.25 mL de AG3 (ácido giberélico) y agregarlo al vaso de precipitado. • Jeringas de 1 mL, 5 mL y 10 mL 6. Con una jeringa de 5 mL medir 2 mL de pantotenato de calcio y agregarlo al vaso de precipitado. • Micropipeta de 1 mL y puntas estériles 7. Llevar a volumen final de 1 L (con los 300 mL de agua destilada de la probeta). • Magnetos 8. Ajustar el pH a 5.6 con la ayuda de las soluciones de HCl (0.1 N) o NaOH (0.1 N). • Pipetas Pasteur 9. Añadir 6 g de agente gelificante (agar), agregar todo el contenido y asegurarse de hacerlo muy • Bandejas de poliestireno para pesar cerca del vaso de precipitado, pues el aire puede difuminar parte del contenido. • pH-metro 10. Disolver el gelificante con ayuda del calor, para ello colocar el vaso de precipitado en el horno • Balanza microondas por aproximadamente 5 minutos. Una vez licuado el agar, usar guantes para sacarlo fuera del microondas. • Soluciones de NaOH (0.1 N) y HCl (0.1 N) 11. Usando un dosificador, dispensar 10 mL del medio en los tubos, colocar las tapas, poner un pedazo de cinta indicadora de autoclave y rotular adecuadamente poniendo el nombre del Preparación del medio de cultivo (1L): medio de cultivo y la fecha de preparación. 1. Antes de la preparación de los medios de cultivo es necesario disponer de materiales estériles 12. Esterilizar en autoclave los tubos con medio de cultivo a 121 °C durante 15 minutos. y de recipientes dosificadores adecuados. 13. Dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente. 2. Medir 1 L de agua destilada en una probeta, y transferir aproximadamente 700 mL en el vaso de precipitado. Colocar un magneto y ponerlo sobre el agitador magnético y encender. 14. Guardar el material esterilizado a 4 °C hasta el momento de su uso. 3. Utilizar una bandeja para pesar 4.43 g de la sal MS y agregarlo al vaso de precipitado (Tabla 8). Tabla 7 4. Utilizar una bandeja para pesar 20 g de sucrosa y agregarlo al vaso de precipitado. Concentración de los componentes en el medio para mashua (volumen final 1 L) 5. Medir con la ayuda de una micropipeta 1 mL de Base RTA (Raíces Tuberosas Andinas), 1 mL de Componente 1 L pantotenato de calcio, 0.5 mL de AG3 (ácido giberélico) y agregarlo al vaso de precipitado. Sal MS 4.43 g Base RTA´s 1 mL 6. Llevar a un volumen final de 1 L (con los 300 mL de agua destilada de la probeta). Pantotenato de calcio 2 000 ppm 2 mL 7. Ajustar el pH a 5.7 con la ayuda de las soluciones de HCl (0.1 N) o NaOH (0.1 N). AG3 100 ppm 0.25 mL 8. Añadir 6.5 g de agente gelificante (agar), agregar todo el contenido y asegurarse de hacerlo Sucrosa 20 g muy cerca del vaso de precipitado pues el aire puede difuminar parte del contenido. Agar 6 g 9. Disolver el gelificante con ayuda del calor, para ello colocar el vaso de precipitado en el horno pH= 5.6, esterilizar microondas por aproximadamente 5 minutos. Una vez licuado el agar, usar guantes para sacarlo fuera del microondas. 24 25 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA 10. Usando un dosificador, dispensar 10 mL del medio en los tubos, colocar las tapas, poner un Preparación del medio de cultivo (1 L) pedazo de cinta indicadora de autoclave y rotular adecuadamente poniendo el nombre del medio de cultivo y la fecha de preparación. 1. Antes de la preparación de los medios de cultivo es necesario disponer de materiales estériles y de recipientes dosificadores adecuados. 11. Esterilizar en autoclave los tubos con medio de cultivo a 121 °C durante 15 minutos. 2. Medir 1 L de agua destilada en una probeta, y transferir aproximadamente 700 mL en el vaso 12. Dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente. de precipitado. Colocar un magneto y ponerlo sobre el agitador magnético y encender. 13. Guardar el material esterilizado a 4 °C hasta el momento de su uso. 3. Utilizar una bandeja de poliestireno para pesar 4.43 g de la sal MS y agregarlo al vaso de precipitado (Tabla 9). Tabla 8 Concentración de los componentes en el medio para yacón (volumen final 1 L) 4. Utilizar una bandeja para pesar 20 g de sucrosa y agregarlo al vaso de precipitado. Componente 1 L 5. Pesar 0.1 g de Myo-inositol y agregar al vaso precipitado. Sal MS 4.43 g 6. Medir con la ayuda de una micropipeta 1 mL de tiamina 1 000 ppm y agregarlo al vaso de pre- Base RTA’s 1 mL cipitado. Llevar a volumen final de 1 L (con los 300 mL de agua destilada de la probeta). Pantotenato de calcio 2 000 ppm 1 mL 7. Ajustar el pH a 5.7 con la ayuda de las soluciones e HCl (0.1 N) o NaOH (0.1 N). AG3 100 ppm 0.5 mL Sucrosa 20 g 8. Añadir 7.5 g de agente gelificante (agar), agregar todo el contenido y asegurarse de hacerlo Agar 6.5 g muy cerca del vaso de precipitado pues el aire puede difuminar parte del contenido. pH= 5.7, esterilizar 9. Disolver el gelificante con ayuda del calor, para ello colocar el vaso de precipitado en el horno microondas por aproximadamente 5 minutos. Una vez licuado el agar, usar guantes para 4.5. Tomate de árbol: Medio de Conservación a Corto Plazo (TACP) sacarlo fuera del microondas. 10. Usando un dosificador, dispensar 10 mL del medio en los tubos, colocar las tapas, poner un Materiales antes de la preparación del medio: pedazo de cinta indicadora de autoclave y rotular adecuadamente poniendo el nombre del • Tubos de ensayo de 25 mm x 150 mm con sus respectivas tapas de polipropileno (verificar que medio de cultivo y la fecha de preparación. estos materiales se encuentren íntegros y sin rajaduras) 11. Esterilizar en autoclave los tubos con medio de cultivo a 121 °C durante 15 minutos. • Gradillas para tubos de 25 mm x 150 mm 12. Dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente. • Vaso de precipitado de 2 L 13. Guardar el material esterilizado a 4 °C hasta el momento de su uso. • Probeta de 1 mL Tabla 9 • Jeringas de 1 mL, 5 mL y 10 mL Concentración de los componentes en el medio para tomate de árbol (volumen final 1 L) • Micropipeta de 1 mL y puntas estériles Componente 1L • Magnetos Sal MS 4.43 g Tiamina HCl 1 000pm 1 ml • Pipetas Pasteur Myo-inositol 0.1 g • Bandejas de poliestireno para pesar Sucrosa 20 g • pH-metro Agar 7.5 g • Balanza pH= 5.7, esterilizar • Soluciones de NaOH (0.1 N) y HCl (0.1 N) 26 27 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA 5. Procedimientos para la identificación de microorganismos contaminadores Las medidas preventivas de contaminación en condiciones in vitro es una actividad fundamental para garantizar el éxito del cultivo de tejidos in vitro. Por tanto, es necesario mantener a los cultivos libres de microorganismos contaminadores. Un amplio rango de microorganismos (hongos, bacterias, levaduras y virus) se ha identificado como contaminantes en el cultivo de tejidos vegetales. Estos microorganismos pueden provenir entre otros de los tejidos vegetales (endófitos), del área de trabajo, de los instrumentos de trabajo, de los recipientes y de las personas (Pérez, Leyva, Magallanes, Arce y Méndez, 2016). Como contaminantes in vitro de plantas se han aislado especies de bacterias pertenecientes a los géne- ros: Micrococcus, Bacillus, Staphylococcus, Pseudomonas, Enterobacter, Xanthomonas, Erwinia, Agro- bacterium, entre otros; mientras que los hongos más comúnmente introducidos al cultivo de tejidos in vitro se encuentran los géneros Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, entre otros (Hernández y Gonza- les, 2010). La limpieza consiste en la eliminación de suciedad, material grueso, materia orgánica y manchas en pi- sos, muebles y repisas usando desinfectantes. Este proceso incluye una limpieza preliminar, mediante la aspiración, desempolvado en seco, lavado o fregado con un paño y agua con jabón o detergente. La Figura 9. Bacterias contaminantes en el cultivo in vitro. Izquierda: hongo color limpieza preliminar permite lograr una correcta desinfección ya que las partículas de tierra o materia negro en yacón. Derecha: hongo color negro en oca. orgánica pueden contener microorganismos que interferirían con la acción de los desinfectantes. 5.1. Microorganismos más comunes en los cultivo de tejidos in vitro Dentro de las evaluaciones fitosanitarias se encontraron microorganismos como bacterias y hongos, estos aún no han sido identificados, sin embargo, a continuación se muestran las fotos de las muestras halladas. Se observó la presencia de un hongo de color negro, semejante al género Penicillium (Figura 9). En cuanto a bacterias, existen especies de bacterias color amarillo y rosado alrededor del algunos explantes de yacón; además, se ha detectado visualmente dos tipos de bacterias en explantes de oca (Figura 10). Figura 10. Bacteria con colonia color crema (izquierda) y bacteria con pigmento rosado (derecha) infectando al cultivo de oca. 28 29 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA 6. Procedimientos adicionales Nota: Después de cada subcultivo se debe esterilizar las pinzas y el bisturí que se hayan utilizado y dejarlos enfriar. 6.1 Desinfección de cámara de flujo laminar y herramientas para el cultivo in vitro Al iniciar actividades de cultivo in vitro se debe seguir los siguientes pasos: A B a. Encender la luz blanca de la cámara de flujo laminar. b. Encender el esterilizador de perlas y dejar hasta que alcance una temperatura de 250 °C. c. Desinfectar todas las superficies internas de la cámara con un papel toalla embebido en etanol (70%). d. Limpiar las herramientas con papel toalla con etanol (70 %) para retirar los residuos. e. Colocar dentro de la cámara todos los materiales necesarios para la propagación: papel estéril, 2 placas petri grandes estériles, 4 pinzas, 4 navajas bisturí nuevos estériles, 4 mangos de bisturí, papel toalla, pizeta conteniendo etanol (70 %), un frasco de vidrio con etanol (70 %) para la desinfección y 1 mechero (con alcohol al 96 %). f. Encender la luz Ultra Violeta durante 15 minutos, luego encender la cámara de flujo y dejar operar al menos 15 minutos. C D 6.2 Procedimiento para realizar subcultivo de material vegetal a. En un coche multiusos colocar una gradilla con las accesiones a subcultivar, una gradilla con nuevo medio de cultivo, etiquetas nuevas, una bandeja para descartar los tubos, y una bolsa para descartar los desechos vegetales producto de la propagación. b. Desinfectarse las manos con alcohol (70 %), colocarse una mascarilla y un gorro descartable. c. Dentro de la cabina coger con la pinza un bloque de papel estéril para soporte (Figura 11A). Escoger un tubo por accesión, retirar el film de polietileno y con ayuda de una pinza retirar la plántula y colocarla sobre el papel (Figura 11B). Con el bisturí cortar las hojas y dejar solo el tallo; realizar cortes en diagonal entre nudo y nudo (Figura 11C). Figura 11. Procedimiento para subcultivo. A) Manipulación del bloque de papel estéril. B) Retiro del film de polietileno y retiro de la plántula. C) Corte de las hojas y cortes en diagonal entre nudo y nudo. D) Introducción de los entrenudos d. Con la ayuda de una pinza coger los entrenudos e introducirlos en un nuevo medio de en un nuevo medio de cultivo. cultivo (Figura 11D). Dependiendo del cultivar, colocar cuatro entrenudos (oca, ulluco y mashua), tres entrenudos (yuca) o un entrenudo (yacón y tomate de árbol). e. Etiquetar los tubos y colocar la fecha de realización del subcultivo. Colocar la etiqueta sobre el tubo y sellar con film de polietileno. Continuar los subcultivos para las demás accesiones. f. Terminado el subcultivo, llevar las accesiones renovadas al cuarto de conservación a 20 °C para su establecimiento y monitoreo de viabilidad. 30 31 Manual de conservación in vitro en el /// Instituto Nacional de Innovación Agraria Banco de Germoplasma del INIA 6.3 Lavado de material de vidrio con plántulas in vitro no contaminadas y contaminadas 6.5 Limpieza y desinfección de los cuartos de incubación y conservación del banco in vitro a. Por material en contacto con plántulas in vitro, se entiende todo recipiente (tubo de a. La actividad debe ser realizada semanalmente por el personal técnico encargado. ensayo, bolsa o frasco) que ha contenido o contiene plántulas in vitro. b. Para la limpieza de los pisos de los cuartos de incubación se utiliza 15 mL de desinfectante b. Retirar los restos de etiqueta y sellador plástico de los recipientes. y 50 mL de lejía diluidos en 1L de agua. c. Colocar los tubos boca arriba en las canastas de autoclave. No retirar las tapas de los c. Cada mes, realizar la limpieza de anaqueles, puertas y paredes de los cuartos de cultivo. tubos. Retirar el polvo con una franela y utilizar papel toalla sumergido en alcohol (96 %) para su desinfección. d. Colocar las canastas con tubos y/o frascos en la autoclave y esterilizar. e. Después de la esterilización, usando guantes, retirar los residuos vegetales y/o de 6.6 Tratamiento de explantes contaminados con bacterias medio de cultivo de los recipientes aprovechando que el medio con agar se encuentra líquido. Colocar estos restos en una bolsa que será recogida y eliminada por el personal a. Preparar cefotaxima (20 %), pesando 2 g del antibiótico y disolver en 10 mL de agua encargado de la actividad. destilada. Esterilizar por filtración y almacenar a - 20 °C. f. Sumergir en agua las tapas y los recipientes por separado. b. Cortar 1 cm2 de papel filtro y colocarlos en placa de Petri para esterilizar (Figura 12A). g. Lavar los recipientes y tapas con agua, detergente y con escobillas. Emplear detergentes c. Agregar al papel filtro el antibiótico preparado, sellar y guardar hasta su uso. suaves de fácil enjuague que no se adhieran a los recipientes. Enjuagar de dos a tres d. Abrir el tubo en la cámara de flujo laminar y con una pinza estéril coger un papel filtro veces y escurrir. Realizar el lavado final con agua destilada y dejar secar en estantes. con antibiótico e introducirlo en el medio de cultivo nuevo (Figura 12B). e. Identificar los tubos que contienen bacterias, subcultivar en los tubos con papel filtro, 6.4 Descarte de material contaminado con microorganismos sellar el tubo y dejar crecer a 21 °C (Figura 12C). a. Todo material contaminado con microorganismos se entiende como todo recipiente que ha contenido, contiene o haya estado en contacto con microorganismos visibles (hongos y bacterias). b. Colocar los recipientes en bolsas autoclavables. Los tubos de ensayo y frascos se colocan tapados. c. Se lleva al área de lavado para esterilizar en el autoclave. d. Después de la esterilización, retirar las tapas de los tubos de ensayo y envases descontaminados. Retirar el film de polietileno (plástico) utilizando un bisturí de descarte (proveniente del contenedor de bisturís usados), seguido, retirar los residuos vegetales y/o medio de cultivo de los recipientes. Colocar estos restos en una bolsa que será recogida y eliminada por el personal encargado por la actividad. e. Sumergir en agua las tapas y los recipientes separadamente. f. Lavar los recipientes y tapas con agua, detergente y escobillas. Emplear detergentes suaves de fácil enjuague que no se adhieran a los recipientes. Enjuagar de dos a tres veces, escurrir y secar en estantes. g. Guardar los recipientes y tapas secos en cajas y bolsas, respectivamente. 32 33 /// Instituto Nacional de Innovación Agraria A B 7. Referencias Aguirre, G., Baudoin, J. y Leigue, L. (2016). Aplicación del Cultivo de Tejidos en la Multiplicación y Conservación de los Recursos Fitogenéticos. Comisión Universitaria para el Desarrollo (CUD) y Consejo Interuniversitario de la Comunidad Francesa de Bélgica (CIUF). Bolivia. Recuperado de https://orbi.uliege.be/bitstream/2268/212904/1/Aguirre%2C%20Baudoin%2C%20 Leigue%20UMSS%202016.pdf Bonilla, M., Mancipe, C. y Aguirre, A. (2015). Conservación in vitro: una perspectiva para el manejo de los recursos fitogenéticos. Revista de Investigación Agraria y Ambiental, 6(1), 67-82. Bray, E., Bailey-Serres, J. y Weretilnyk, E. (2000). Responses to abiotic stresses. In: Buchanan B., Gruis- sem W., y Jones R. Biochemistry and molecular biology of plants. 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