Manual de conteo cromosómico del yacón (Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson) mediante la técnica squash Ministerio de Agricultura y Riego MINISTERIO DE AGRICULTURA Y RIEGO INSTITUTO NACIONAL DE INNOVACIÓN AGRARIA DIRECCIÓN DE RECURSOS GENÉTICOS Y BIOTECNOLOGÍA - DRGB Proyecto 092_PI “Variación del contenido de fructooligosacáridos (FOS) en accesiones promisorias de yacón: caracterización, clonamiento y análisis funcional de un fragmento de ADN complementario de la hidrolasa responsable de su degradación”. MANUAL DE CONTEO CROMOSÓMICO DEL YACÓN (SMALLANTHUS SONCHIFOLIUS (POEPP. & ENDL.) H. ROBINSON) MEDIANTE LA TÉCNICA SQUASH Ministerio de Agricultura y Riego Editor general: Ministro de Agricultura y Riego Eliana Alviárez Gutierrez, M.Sc. Ing. Jorge Luis Montenegro Chavesta Revisión de contenido: 1. Introducción 3 Viceministro de Desarrollo e Infraestructura Agraria y Riego Betty Flores Gonzales 2. Incremento de raíces de vitroplantas 6 Econ. Carlos Alberto Ynga La Plata Heillen Calderón Castillo 3. Preparación de batería de reactivos para tinción de células metafásicas de raíces 7 Gabriela Salazar Alvarez Viceministra de Políticas Agrarias 4. Tinción cromosómica 8 Econ. Paula Rosa Carrión Tello Diseño y diagramación: 4.1 Prefijación 10 Abner Fernando Mio Torrejón Jefe del INIA Luis Carlos Arévalo Mercado 4.2 Fijación 11 Jorge Luis Maicelo Quintana, Ph. D. Jeams López Acaro 4.3 Hidrólisis 12 © Instituto Nacional de Innovación Agraria – INIA Publicado: 4.4 Tinción 13 Proyecto 092_PI diciembre, 2019 5. Técnica squash 13 “Variación del contenido de fructooligosacáridos (FOS) Primera Edición: 6. Conteo cromosómico 15 en accesiones promisorias de yacón: caracterización, diciembre, 2019 clonamiento y análisis funcional de un fragmento de 7. Anexo Protocolo para el conteo cromosómico del yacón mediante squash 16 ADN complementario de la Hidrolasa responsable de su Tiraje: 8. Glosario 17 degradación”. 2000 ejemplares 9. Referencias 18 Elaboración de contenido: Impreso en: Blga. Rosa Maria Cabrera Pintado Nombre de la imprenta: Vayu advertising Blga. Milca Gianira Elespuru Shuña & communications S.A.C. RUC: 20604037361 Equipo técnico: Teléfono: 964389548 Blga. Rosa María Cabrera Pintado Dirección: De los ingenieros Nro. 110 Dpto. 102 Blga. Milca Gianira Elespuru Shuña Urb. Valle Hermoso Lima - Lima - Santiago de Surco Blga. Jérica Danae Aliaga Cóndor E-mail: ventas@vayucomunicaciones.com Editado por: ISBN: Instituto Nacional de Innovación Agraria - INIA 978-9972-44-042-7 Equipo Técnico de Edición y Publicaciones Av. La Molina 1981, Lima - Perú (51 1) 240-2100 / 240-2350 www.inia.gob.pe Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú N° 2019-18934 Prohibida la reproducción de este libro por cualquier medio, total o parcialmente, sin permiso expreso. 1. Introducción El yacón (Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson), es una planta herbácea conocida en el norte peruano como “yacón”, “llacón” o “lajuash” y en el centro del Perú como “aricoma”. En Bolivia “yakuma”, en Ecuador “jícama”, “jíquima”; en Colombia y Venezuela “jíquima” y “jiquimilla” (López, 2005). La planta crece hasta 1.5 - 3 m de altura, posee tallo cilíndrico angular, surcado, hueco en la madurez y densamente pubescente en la parte superior (Grau y Slanis, 1996; Wells, 1965). Las raíces son fusiformes y ovaladas, de color blanco, crema o púrpura y tiene múltiples flores de color amarillo-naranja. (Seminario, Valderrama y Manrique, 2003; Hermann, 1997). Las raíces reservantes del yacón son comestibles y tiene gran contenido de agua, que representa entre el 83 % y 90 % del peso fresco de las raíces (Hermann, 1997). Los tubérculos poseen un agradable sabor dulce y dejan una sensación refrescante después de consumirlo, razón por la cual en la región andina es considerada como fruta. El sabor dulce se atribuye principalmente a los fructooligosacáridos (FOS), un tipo de azúcar con atributos beneficiosos para la salud humana (Seminario et al., 2003), que son almacenados en las raíces. Por estas razones, el yacón ha ganado progresivamente mayor aceptación mundial, logrando expandir su cultivo a varios países como Nueva Zelanda, Japón y Brasil (Campos et al., 2012). En el yacón, la baja capacidad de reproducción sexual es una limitante importante para el mejoramiento genético (Viehmannova et al., 2013); esto se debe principalmente a su origen alopoliploide. León (1964) e Ishiki et al. (1997) han reportado especímenes de 2n = 32 hasta 2n = 87, constituyendo esto un problema para su caracterización. Conocer el nivel de ploidía del yacón es un aspecto muy importante para estudios de mejoramiento genético. Singsit y Ozias-Akins (1992) refieren que el conteo de cromosomas en células meristemáticas es un método confiable para la determinación del número de cromosomas y nivel de ploidía de una especie. En el conteo cromosómico mediante la técnica squash es necesario usar tejidos meristemáticos como el de la raíz, por estar en constante crecimiento longitudinal y diagonal (mitosis), siendo el más utilizado (Roth citado por Valladolid et al., 2004). Como uno de los resultados del Proyecto 092_PI: Variación del contenido de fructooligosacáridos (FOS) en accesiones promisorias de yacón: Caracterización, clonamiento y análisis funcional de un fragmento de ADN complementario de la hidrolasa responsable de su degradación, se ha elaborado el presente manual que describe el protocolo para el conteo cromosómico de yacón mediante la técnica de squash. Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para el conteo cromosómico del yacón 2. Incremento de raíces de vitroplantas • Material vegetal: cuellos de vitroplantas de yacón (Figura 1). • Metodología: El medio de cultivo a usar es el medio basal de Murashige y Skoog - MS (1962) complementado con sacarosa 30 g.L-1, carbón activado 1 g.L-1 y 0.4 mg. L-1 de ácido naftalén acético (NAA) y agar 7 g.L-1. El pH deberá ajustarse a 5.7 ± 0.01, para luego dispensar 10 mL de medio de cultivo en tubos de 25 x 150 mm. Tapar y esterilizar a 15 psi, 121 °C durante 15 minutos. Figura 2. Raíces de yacón adecuadas para el conteo cromosómico. Bajo condiciones estériles en cámara de flujo laminar, con ayuda de pinzas y bisturí, aislar los explantes (cuello de vitroplanta) y sembrar uno en cada tubo conteniendo 3. Preparación de batería de reactivos para tinción de el medio de cultivo previamente esterilizado. Tapar, rotular, sellar e incubar a 15 °C con fotoperiodo de 16 horas luz durante 6 semanas. células metafásicas de raíces Pasado el tiempo de incubación, se dispone de cantidad suficiente de raíces para • 8-Hidroxiquinolina 2mM realizar el conteo cromosómico (Figura 2). Disolver 5.8 mg de 8- hidroxiquinolina en 0.5 mL de alcohol etílico absoluto, agregar 19.5 mL de agua destilada para completar un volumen final (Vf) de 20 mL. Almacenar en frasco ámbar a temperatura ambiente. • Ácido clorhídrico HCl 1N (Vf=250 mL) Añadir 229.18 mL de agua destilada en una probeta, luego agregar 20.82 mL de HCl vertiendo lentamente por las paredes de la probeta. Almacenar en frasco ámbar a temperatura ambiente. • Orceína acético-láctica (Vf =100 mL) Disolver 2 g de orceína sintética (SIGMA O7380) en 100 mL de una solución compuesta por 45 mL de ácido láctico y 55 mL de ácido acético glacial p.a. Calentar hasta la primera ebullición y filtrar con papel filtro N° 05. Almacenar en frasco ámbar a temperatura ambiente. • Reactivo de Carnoy A B El reactivo se debe preparar unos minutos antes de usarlo, consta de 12 gotas de alcohol absoluto, 2 gotas de ácido acético y 6 gotas de cloroformo. Se recomienda Figura 1. Material vegetal. (A) Vitroplanta de yacón. (B) Explante de yacón-cuello de vitroplanta. realizar la mezcla directamente en el tubo que contiene las muestras. 6 7 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para el conteo cromosómico del yacón 4. Tinción cromosómica A B Después de 6 semanas de desarrollo de las vitroplantas, se aislan los ápices radiculares de 1 cm de longitud. Las raíces se colectan usando pinzas de punta fina y se colocan en placas de petri de vidrio de 100 mm de diámetro conteniendo agua destilada para limpiar y retirar los restos de medio de cultivo (Figuras 3 y 4). Depositar las raíces en tubos eppendorf (Figura 5). Se recomienda ejecutar el proceso entre las 08:00 a. m. y 10:00 a. m., ya que durante este periodo del día existe mayor número de células en división (Quijia-Lamina, 2010) y por lo tanto, se incrementa la probabilidad de encontrar células en metafase. A B Figura 4. Aislamiento de ápices radiculares. (A) Corte de raíces para procesamiento. (B) Ápices radiculares para prefijación. Figura 3. Procesamiento de material vegetal. (A) Extracción de vitroplanta del medio de cultivo. (B) Plántula lista para seccionar las raíces. Figura 5. Ápices radiculares ubicados en tubos eppendorf. 8 9 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para el conteo cromosómico del yacón 4.1 Prefijación 4.2 Fijación Adicionar dos gotas de 8-hidroxiquinolina (2 mM) (inhibidor de mitosis) en el tubo Adicionar el reactivo de Carnoy en el tubo eppendorf conteniendo las muestras eppendorf conteniendo los ápices radiculares (Figura 6A). Dejar reposar a 4 °C y lavar (Figura 7). Dejar reposar a 4 °C durante 3 horas y luego lavar con agua destilada. con agua destilada (Figura 6B). A B Figura 6. Prefijación. (A) Adición de 8-hidroxiquinolina 2 mM a los ápices radiculares. (B) Lavado con agua destilada. Figura 7. Adición del reactivo de Carnoy. 10 11 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para el conteo cromosómico del yacón 4.3 Hidrólisis 4.4 Tinción En un vaso de precipitado de 20 mL agregar 3 mL de HCl (1N), calentar a 60 °C hasta En el tubo eppendorf agregar dos gotas de orceína acético-láctica (Figura 9), que se observe vapor en las paredes del vaso. Seguidamente retirar las raíces del asegurando que la raíz quede totalmente inmersa en la solución, e incubar a tubo eppendorf y colocarlas en el vaso precipitado por 2 minutos (Figura 8). Lavar temperatura ambiente durante 30 minutos. con agua destilada y colocar nuevamente las raíces en los tubos eppendorf. Figura 9. Tinción de raíces con orceína acético-láctica. 5. Técnica de squash En una lámina porta objetos colocar una raíz, con ayuda del bisturí eliminar toda la zona pilífera, dejando únicamente el meristema apical y la cofia (corte de 1 a 2 mm). Luego agregar unas gotas de solución de orceína acético-láctica (Figura 10A). Flamear la lámina por 1 segundo (Figura 10B) y colocar la lámina cubre objetos (Figura 10C). Enseguida realizar presión uniforme con los dedos, y con ayuda de la punta de un lápiz y del lado del borrador realizar suaves golpes para extender la muestra (Figura 10D). Colocar la lámina entre el papel filtro y luego realizar el squash ejerciendo presión uniforme con el pulgar sobre el cubre objeto, de tal manera que las células queden en un mismo plano y los Figura 8. Proceso de hidrólisis de las raíces cromosomas dispersos (Figura 10E). 12 13 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para el conteo cromosómico del yacón 6. Conteo cromosómico Con la ayuda del microscopio óptico enfocar las células con el objetivo de menor aumento (4X). Una vez ubicadas las células metafásicas, agregar una gota de aceite de inmersión a la A lámina y enfocar con el objetivo de 100X.E Empleando el software NIS-Elements versión 4.40, contabilizar el número de cromosomas (Figura 11). Con el tornillo micrométrico enfocar y capturar en secuencia 4 a 6 fotos desde diferentes ángulos, abarcando toda la imagen. Posteriormente usar el software de apilamiento para cada grupo de fotos, para así obtener mejores imágenes de los cromosomas. A B B D C Figura 11. (A) Observación al microscopio compuesto (B) para el conteo de cromosomas con el software NIS- Elements version 4.40. Figura 10. Desarrollo de la técnica de squash. (A) Ápice radicular teñido, (B) flameo de la lámina, (C) lámina con cubre objetos, (D) presión uniforme con un lápiz y (E) realizado del squash. 14 15 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para el conteo cromosómico del yacón 7. Anexo 8. Glosario MMAATTEERRIIAALL BBIIOOLLÓÓGGIICCOO • Explante: cualquier parte de la planta con la cual se inicia el cultivo in vitro. “Cuellos de vitroplantas de Yacón” • Vitroplanta: plántula obtenida por técnicas de cultivo de tejidos vegetales. OBTENCIÓN DE MERISTEMOS RADICULARES • Cuellos de plántulas in vitro de yacón en medio MS + vitaminas + sacarosa 3 % (P/V) + carbón ac�vado 0.1 % (P/V) + NAA 0.4 mg. L-1 + agar 0.7 % (P/V) • Luego de 6 semanas colectar las raíces de los explantes. • Depositar las raíces en tubos eppendorfs. Pre-fijación Fijación Hidrólisis Tinción 8 – hidroxiquinolina Reac�vo de Carnoy HCL (1N) por Orceína acé�co-lác�ca (2mM) por 3 horas. por 1 hora. 2 minutos. por 30 minutos. TÉCNICA DE SQUASH • Cortar las puntas de las raíces (1 a 2 mm longitud) y agregar unas gotas de �nción en lámina porta objeto. • Cubrir con lámina cubre objetos. • Realizar presión uniforme con ayuda de la punta del lápiz y el borrador golpeando suavemente la muestra. • Colocar la lámina en papel filtro, presionar con el pulgar para extender la muestra y remover restos de �nción. OBSERVAR EN MICROSCOPIO ÓPTICO Figura 12. Protocolo para el conteo cromosómico de yacón mediante la técnica de squash. 16 17 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para el conteo cromosómico del yacón 9. Referencias Viehmannova, I., Bortlova, Z., Vitamvas, J., Cepkova, P.H., Eliasova, K., Svobodova, E. y Travnickova, M. (2013). Assessment of somaclonal variation in somatic embryo- Campos, D., Betalleluz-Pallardel, I., Chirinos, R., Aguilar-Gálvez, A., Noratto, G. y Pedreschi, derived plants of yacón [Smallanthus sonchifolius (Poepp. and Endl.) H. Robinson] R. (2012). 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