Revista peruana de biología 27(2): 255 - 260 (2020) Transferibilidad de marcadores microsatélites de doi: http://dx.doi.org/10.15381/rpb.v27i2.15015 Anas platyrhynchos al pato criollo peruano Cairina ISSN-L 1561-0837; eISSN: 1727-9933 Universidad Nacional Mayor de San Marcos moschata domestica Nota científica Cross species transferability of microsatellite markers from Presentado: 12/02/2019 Anas platyrhynchos to Peruvian Muscovy Duck Cairina mos- Aceptado: 23/07/2019 chata domestica Publicado online: 25/05/2020 Editor: Resumen El pato criollo peruano (Cairina moschata domestica) es una de las especies de mayor importancia económica en la alimentación humana. Las especies de patos forman grupos genéticos complejos y difíciles de reconocer, por lo que el uso Autores marcadores microsatélites (SSR) identificados en una especie relacionada como Wendy Acuña* Anas platyrhynchos, representa una opción atractiva, de menor costo y útil para w.acunarodriguez@gmail.com resolver temas relacionados con la conservación de la diversidad genómica, flujo https://orcid.org/0000-0003-3131-1197 génico e hibridación entre poblaciones. El objetivo de la investigación fue evaluar Claudia Yalta la transferibilidad de 24 SSR identificados para A. platyrhynchos a las poblaciones clayama29@gmail.com peruanas de C. moschata doméstica y determinar el grado de polimorfismo (PIC) https://orcid.org/0000-0002-4469-4695 de los marcadores transferibles. Para ello, se obtuvo ADN a partir de plumas alares Eudosio Veli usando el método cloroformo-alcohol isoamílico. Los SSR se construyeron con una eudosio.veli77@gmail.com, sdb@inia.gob.pe secuencia adicional de 19 pb (cola M13) y se utilizaron fluoróforos 6-FAM, VIC, NED Correspondencia y PET para su etiquetado. Los fragmentos amplificados fueron visualizados en geles *Corresponding author de agarosa 2% y separados por electroforesis capilar en un secuenciador automá- tico ABI 3130XL. Los resultados mostraron 7 SSRs con un valor PIC alto (PIC>0.5) Instituto Nacional de Innovación Agraria, Subdirección de Biotecnología, Dirección de Recursos Genéticos y y que el marcador CMO211 se expresaba con un tamaño molecular menor del de Biotecnología, Lima 12, Perú. la referencia. En conclusión, el presente trabajo demostró que el 75% de los SSR diseñados para A. platyrhynchos son transferibles a C. moschata domestica; y que sólo 7 fueron altamente informativos. Demostrando así que los SSRs son útiles en la detección de polimorfismos en especies relacionadas y pueden ser usados para mejorar las poblaciones peruanas de patos criollos. Abstract Peruvian Muskovy duck (Cairina moschata domestica) is one of the most economica- lly important species in human nutrition. Duck species form complex genetic groups Citación which are difficult to recognize, thus the use microsatellite markers (SSRs) identified already in Anas platyrhynchos (related species), represents a very attractive option Acuña W., C. Yalta y E. Veli. 2020. Transferibilidad de for its cheapness and usefulness for solving issues related to conservation of geno- marcadores microsatélites de Anas pla- mic diversity, gene flow and hybridization between population. The main goal of tyrhynchos al pato criollo peruano Cairina this work was to evaluate the degree of polymorphism (PIC) and the transferability moschata domestica. Revista peruana de of 24 SSRs identified for A. platyrhynchos to C. moschata domestica. In this study, biología 27(2): 255 - 260 (Mayo 2020). doi: http://dx.doi.org/10.15381/rpb.v27i2.15015 DNA collected from wing feathers was extracted using the chloroform-isoamyl alcohol method. SSRs were constructed with an additional 19 bp sequence (M13 tail) and 6-FAM, VIC, NED and PET fluorophores were used for their labeling. The amplified fragments were visualized on 2% agarose gels and separated by capillary electrophoresis in an automatic ABI 3130XL sequencer. Results showed 7 SSR with high PIC value (PIC> 0.5) and the CMO211 marker expressed in a smaller molecular size that the one used as reference. In conclusion, we showed that 75% of the SSR designed for A. platyrhynchos were transferable to C. moschata domestica as well as we found only 7 SSR highly informative, thus we proved that SSR are highly useful for detecting polymorphisms in related species and improved the Peruvian populations of Muskovy ducks. Palabras clave: Cairina mochata domestica; transferibilidad; PIC; cola M13; electroforesis capilar; SSR. Keywords: Cairina mochata domestica; Marker Transferability; PIC; M13 tail; capillary elec- trophoresis; SSR. _________________________________________________________________ Journal home page: http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/rpb/index © Los autores. Este artículo es publicado por la Revista Peruana de Biología de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Este es un artículo de acceso abierto, distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial- CompartirIgual 4.0 Internacional.(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), que permite el uso no comercial, distribución y repro- ducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada. Para uso comercial póngase en contacto con:revistaperuana. biologia@unmsm.edu.pe. 255 Wendy Acuña et al. Introducción Finalmente, en un volumen de 10 µL, se contuvo 1X buffer El pato Pekín (Anas platyrhynchos) y el pato criollo de PCR, dNTPs 0.2 mM, MgCl2 1.5 – 3.0 mM, cebador 0.03 – (Cairina moschata domestica) son consideradas aves do- 0.4 µM, 0.1 U de Taq Polimerasa y 2 µL de ADN (30 ng/µL). mésticas de interés económico (Kear 2005, Avilez & Ca- Los programas de amplificación se realizaron en un miruaga 2011). En particular en el pato Pekín se han rea- termociclador de gradiente y consistieron en una fase de lizado la caracterización molecular y el estudio genético desnaturalización inicial 95 °C por 2 min, seguido de 30 de sus poblaciones (Maak et al. 2000, Wang et al. 2004, ciclos de fase de desnaturalización a 95 °C por 45 s, luego El-Gendy et al. 2005, He et al. 2008, Hsiao et al. 2008, Fei una etapa de hibridación del cebador que fue de 50 °C et al. 2009. Shi-Yi et al. 2009, Su & Chen 2009). – 65 °C por 1 min; la fase de extensión del ADN a 72 °C En estudios de genética de poblaciones, la transferi- por 60 s. La fase de extensión final a 72 °C por 10 min y bilidad de marcadores moleculares puede resultar una se detiene a 4 °C por tiempo indefinido (Innis & Gelfand herramienta muy útil para aprovechar la información ge- 1990, Kainz 2000). Adicionalmente, algunos cebadores nerada en especies ampliamente estudiadas y aplicarla requirieron 10 ciclos adicionales a 53 °C por 45 s para en parientes cercanos. Esta herramienta puede aplicarse una mejor hibridación de la cola M13 (Schuelke 2000). a distintos niveles taxonómicos, desde microorganismos Los productos amplificados fueron visualizados me- hasta especies vegetales y animales (Weng et al. 2007, diante electroforesis horizontal en geles de agarosa 2% Cristancho & Escobar 2008, Feng et al. 2009). y posteriormente separados en un analizador genético ABI 3130XL (Applied Biosystems, Foster, CA. USA) me- Así mismo, los marcadores moleculares son una he- diante electroforesis capilar. La primera verificación de rramienta necesaria en muchos campos de la biología los productos amplificados se hizo mediante el revelado (Avise 1994, Hillis & Wiens 2000). Los diferentes tipos de los geles de agarosa 2%, y posteriormente se corrobo- de marcadores empleados en estudios poblacionales o ró estos resultados con la revisión de electroferogramas, estudios evolutivos se distinguen por su capacidad de utilizando el software GeneMapper® Software v.4.0. Fi- detectar polimorfismos en loci únicos o múltiples. Como, nalmente, la prueba de Contenido de Información Poli- por ejemplo, los marcadores de tipo microsatélite (SSR), mórfica (PIC), se realizó con el software Cervus v3.0.7. que son de tipo co-dominante (Simpson 1997), se repi- ten muchas veces en un locus particular y están distri- buidos de manera relativamente uniforme en muchos Resultados loci genómicos diferentes (Tautz & Renz 1984, Wies- De los 24 marcadores SSR evaluados, 18 mostraron senbach & Dib 1992, Weber & Wong 1993, Golstein et al. una amplificación exitosa evidenciándose tanto en los ge- 1996, Provan et al. 1999, Yan et al. 2008). les de agarosa como en electroferogramas obtenidos por el ABI 3130XL: APH01, APH07, APH09, APH13, APH15, La transferibilidad de marcadores se hace posible APH18, APL02, APL11, APT004, APT021, APT025, debido a que las regiones flanqueantes al microsatéli- APT029, AY295, CAUD001, CAUD004, CAUD022, te se mantienen homólogas permitiendo la afinidad de CAUD026 y CMO211. Los 6 marcadores restantes, no cebadores entre especies cruzadas. Adicionalmente, la mostraron amplificación para C. moschata domestica a transferibilidad también proporciona mayor eficiencia pesar de haber realizado múltiples pruebas con variacio- de trabajo, reduciendo costos de insumos y tiempo, lo nes en las concentraciones del cebador, MgCl , y la tem- cual significa mayor oportunidad de investigación en es- 2peratura de hibridación. pecies nuevas. La prueba de Contenido de Información Polimórfi- En este estudio, presentamos los resultados del es- ca (PIC) se realizó con los 18 marcadores exitosamente tudio de la transferibilidad de marcadores SSR del pato transferidos a C. moschata domestica. Sólo 7 marcadores doméstico Pekín A. platyrhynchos al pato criollo peruano mostraron ser altamente informativos, 4 mostraron ser C. moschata domestica. medianamente informativos y 7 poco informativos (Tabla 1). De este último grupo de marcadores, 3 de ellos (APL02, Material y métodos APH15 y CAUD004) resultaron ser de tipo monomórfico. Se utilizó muestras de ADN genómico obtenido a par- Así mismo, se encontró que el marcador CMO211 mostra- tir de plumas de patos criollos Cairina moschata domesti- ba un rango de peso molecular diferente a lo publicado ca originarios de los departamentos de Lambayeque y San para A. platyrhynchos (221-283 pb) (Su et al. 2007). Martín, Perú. Se probaron 24 marcadores microsatélites, los cuales fueron escogidos por su exitosa amplificación y Discusión en función a su alto Contenido de Información Polimórfica La alta tasa de transferibilidad de los SSR evaluados, (PIC) en Anas platyrhynchos pato pekín (Tabla 1). Los ce- refleja el alto grado de conservación entre las especies badores directos fueron construidos con una extensión de estudiadas. En general, a mayor distancia filogenética 19 pb, la cual es complementaria a los fluoróforos 6- FAM menor es el éxito de transferibilidad de los marcadores (azul), VIC (verde), NED (negro) y PET (rojo). (Peakall et al. 1998). Sin embargo, esta conservación de Las reacciones de PCR se estandarizaron con el kit KAPA las regiones flanqueantes al SSR, hace posible considerar Taq PCR, Kapa Biosystems; realizando variaciones a nivel al pato pekín como una especie modelo para la transfe- de concentración de MgCl2, concentración de cebadores y rencia y aplicabilidad de tecnologías en las poblaciones temperatura de hibridación del cebador y de la cola M13. de patos criollos. 256 Rev. peru. biol. 27(2): 256 - 053 (Mayo 2020) Transferibilidad de marcadores microsatélites de Anas platyrhynchos a Cairina moschata domestica Tabla 1. Evaluación de transferibilidad de 24 SSR en Cairina moschata domestica: tamaño del microsatélite, éxito de transferibilidad, temperatura de hibridación y fluoróforo. Transferibilidad LOCUS Tamaño Temperatura de Fluoróforo Referencia (pb) *Visibilidad de Grado de hibridación (°C)amplificado PIC informatividad APH01 Maak et al. 2000, Baratti et al. 2008; Wu et al. 2008. 182-232 si 0.06 bajo 53 NED APH02 Maak et al. 2003; Baratti et al. 2008. - no - - - - APH03 Maak et al. 2000; Wu et al. 2008. - no - - - - APH07 Maak et al. 2000; Baratti et al. 2008; Wu et al. 2008; Khan Ahmadi et al. 2007. 225-295 si 0.614 alto 57 PET APH09 Maak et al. 2000; Baratti et al. 2008; Wu et al. 2008; Khan Ahmadi et al. 2007 75-150 si 0.397 medio 57 PET APH11 Maak et al. 2000; Wu et al. 2008; Khan Ahmadi et al. 2007 - no - - - - APH13 Maak et al. 2003; Wu et al. 2008. 173-220 si 0.616 alto 57 VIC APH15 Maak et al. 2003; Baratti et al. 2008; Wu et al. 2008. 168.2-198 si 0 no informativo 59 6-FAM APH16 Maak et al. 2003; Baratti et al. 2008; Wu et al. 2008. - no - - - - APH18 Maak et al. 2003; Wu et al. 2008. 225-300 si 0.006 bajo 57 VIC APL02 Denk et al. 2004 90-138 si 0 no informativo 59 6-FAM APL11 Denk et al. 2005 70-127 si 0.011 bajo 53 NED APT004 Hsiao et al. 2008 292-352 si 0.313 medio 53 NED APT005 Hsiao et al. 2008 - no - - - - APT21 Hsiao et al. 2008 154-186.5 si 0.624 alto 57 PET APT25 Hsiao et al. 2008 131-171 si 0.779 alto 57 VIC APT29 Hsiao et al. 2008 186.5-224.4 si 0.602 alto 57 PET AY295 Ying Su et al. 2007 245-403 si 0.823 alto 59 6-FAM CAUD001 Huang et al. 2005 300-360 si 0.28 medio 57 PET CAUD004 Huang et al. 2005 199-240 si 0 no informativo 59 6-FAM CAUD022 Huang et al. 2005 128-181 si 0.6 alto 53 NED CAUD024 Huang et al. 2006 - no - - - - CAUD026 Huang et al. 2006 138.5-168.7 si 0.144 bajo 59 6-FAM CMO211 Su et al. 2007 90-130 si 0.451 medio 57 VIC *Visibilidad de amplificados en geles de agarosa 2% y electroferogramas. PIC: Contenido de Información Polimórfica Gradro de informatividad: alto>0.5; 0.25>medio>0.5; bajo<0.25 Es importante resaltar que, al tratarse de especies ser altamente informativos, por lo que se recomiendan y poblaciones diferentes, el valor PIC mostró valores para estudios posteriores de caracterización de las po- totalmente divergentes a las reportadas para A. platyr- blaciones de patos criollos. hynchos (Su et al. 2007, Cristancho & Escobar 2008, Wu et al. 2008, Baratti et al. 2009); incluso a nivel de peso En resumen, los SSR exitosamente transferibles y molecular del microsatélite CMO211, se encontró dife- estandarizados en eficientes protocolos de PCR que se rencias a lo reportado anteriormente (Su et al. 2007). muestran en nuestro trabajo permitirán estudiar las po- El secuenciamiento del SSR ofrecería nuevas directrices blaciones de patos criollos evaluando factores como su para conocer mejor las razones de tal exorbitante cambio diversidad genética, estructura genética poblacional, flujo entre las dos especies, posiblemente ayudaría a conocer génico, evolución, tasa de endogamia, entre otros aspec- y entender mejor los mecanismos evolutivos y/o de do- tos de importancia para la conservación de la especie, así mesticación en estas especies (Aranguren-Méndez et al. como para los programas de mejoramiento genético de la 2005). Así mismo, de los SSR evaluados, siete resultaron misma (Shafer et al. 2012, Orozco-Terwengel 2013, Marín et al. 2014). Rev. peru. biol. 27(2): 257 - 053 (May 2020) 257 Wendy Acuña et al. Finalmente, recomendamos tomar en consideración Innis MA, Gelfand DH. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods los marcadores medianamente informativos ya que, aun- and Applications. San Diego: Academic Press que en menor medida, también reflejan la variabilidad ge- Kainz P. 2000. The PCR plateau phase- towards an unders- nética de población y pueden aportar información valiosa tanding of its limitations. Biochimica et Biophysica para el análisis. Los marcadores monomórficos, por otro Acta 1494: 23-27. https://doi.org/10.1016/S0167- lado, a pesar de ser informativos para las poblaciones de 4781(00)00200-1 pato pekín, no resultaron útiles para las poblaciones de Kear J. 2005. Ducks, geese and swans. Oxford: Oxford Univer- pato criollo, por lo que no es recomendable su uso. sity Press. 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Gladys Gastelo, de la EEA Vista Florida, por su valioso apoyo durante la colecta de muestras. También quisiéramos dar un especial agradecimiento a todos los criadores de patos criollos de los departamentos de San Martín y Lambayeque ya que sin su colaboración este trabajo no hubiera sido posible. Finalmente, agradecer a la Dra. Evelyn Farfán por su apoyo en la revisión y corrección del presente artículo. Conflicto de intereses / Competing interests: Los autores no incurren en conflictos de intereses. Rol de los autores / Authors Roles: EV realizó el diseño de la investigación y WA realizó las pruebas de laboratorio. WA, CY y EV realizaron el análisis de electrofero- gramas y de resultados. WA elaboró el presente artículo. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito. Fuentes de financiamiento / Funding: Instituto Nacional de Innovación Agraria, a través del Proyecto “Uso de Herramientas Moleculares para la Caracterización de Recursos Genéticos Animales”. Aspectos éticos / legales; Ethics / legals: El Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA) del Ministerio de Agricultura y Riego, como autoridad nacional competente; manifiesta mediante el MEMORANDO N°129-2019-MINAGRI- INIA-DGIA/SDRIA y el INFORME N°082-2019-MINAGRI-INIA/ DGIA-SDRIA-ARAPOV, que la especie de estudio no presenta ninguna restricción técnica-legal en el procedimiento de colecta. Rev. peru. biol. 27(2): 259 - 053 (May 2020) 259 Wendy Acuña et al. Página en banco Blank page 260 Rev. peru. biol. 27(2): 260 - 053 (Mayo 2020)