Tropical and Subtropical Agroecosystems 25 (2022): #086 Morales-Pizarro et al., 2022 AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y EVALUACIÓN IN VITRO DE AISLADOS NATIVOS DE Bacillus, Trichoderma Y Streptomyces CON POTENCIAL PARA EL BIOCONTROL DE LOS HONGOS DE LA MADERA DE LA VID † [ISOLATION, IDENTIFICATION AND IN VITRO EVALUATION OF NATIVE ISOLATES OF Bacillus, Trichoderma AND Streptomyces WITH POTENTIAL FOR THE BIOCONTROL OF GRAPEVINE TRUNK FUNGI] Arturo Morales-Pizarro1*, Javier Javier-Alva1, L.A. Álvarez2, Rocío Mayta-Obos3, René Aguilar-Anccota1, Ricardo Peña-Castillo1, Roger Chanduvi-García1 and David Lindo-Seminario4 1 Universidad Nacional de Piura, Campus Universitario s/n. Urb. Miraflores. Piura, Perú. *Email. dmoralesp@unp.edu.pe 2 Universidad Nacional de Cañete, Casa de la cultura, Av. Mariscal Benavides, San Luis de Cañete. Lima, Perú. 3 Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Campus Universitario Av. Juan XXIII 424. Lambayeque, Perú. 4 Estación Experimental Agraria Vista Florida. Subdirección de Recursos Genéticos de la Dirección de Recursos Genético y Biotecnología. Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA), Av. Picsi. Lambayeque, Perú. *Corresponding author SUMMARY Background: Biocontrol of grapevine trunk diseases (GTDs) is a friendly alternative to chemical control that cause resistance and contamination of the ecosystems. Objective: isolate native grapevine root and rhizosphere microorganisms with biocontrol potential of grapevine trunk fungi diseases. Methodology: The competition for substrate (CS) was studied with the Bell´s scale, contact time (CT) between the antagonist-pathogen (days) and the growth inhibition percentage (GIP). Results: Seven Trichoderma strains were isolated (from roots: Tr-1, Tr-2, Tr-3, Tr-6; and from rhizosphere: Tr-4, Tr-5 Tr-7); six Bacillus spp. (from roots: Bac-4, Bac-5, Bac-6; and from rhizosphere: Bac-1, Bac-2, Bac-3); and two Streptomyces sp. (Act-1, Act-2). The CS results evaluated with the Bell scale showed Tr-1, Tr-7, T.atv (Trichoderma atroviride) and T-22 (Trichoderma harzianum) were placed in class 1 against Lasiodiplodia theobromae and, all isolates were placed in class 1 against Campylocarpon pseudofasciculare and Phaeoacremonium parasiticum. The CT of Trichoderma was 2 days (L. theobromae) and 3 days (C. pseudofasciculare and P. parasiticum). In the antibiosis test, Tr-5 (Trichoderma) and Bac-3 (Bacillus) had the highest GIP values (>50%) against the different evaluated pathogens. The isolate Act-2 (Streptomyces sp.) presented a GIP, >70% (L. theobromae), and >40% (C. pseudofasciculare) and >30% (P. parasiticum). Implications: The use of biological control in the management of grapevine trunk diseases is an effective tool, and can be integrated into an integrated management strategy for these pathologies. Conclusions: The native isolates Bac-3 (Bacillus spp.), Tr-5 (Trichoderma spp.), Act-2 (Streptomyces sp.) demonstrated in vitro control against the pathogens L. theobromae, C. pseudofasciculare and P. parasiticum, pathogens associated to grapevine trunk diseases. Keywords: Antagonists; biocontrol; grapevine trunk fungi; rhizosphere; root; table grape. RESUMEN Antecedentes: El biocontrol de las enfermedades fúngicas de la madera de la vid (EMV), es una alternativa amigable frente al control químico causante de resistencia y/o contaminación del ecosistema. Objetivo: aislar microorganismos nativos de raíz y rizósfera de vid con potencial de biocontrol de hongos de la madera de la vid. Metodología: Se estudió la “competencia por sustrato” (CS) con la escala de Bell, “el tiempo de contacto” (TC) entre antagonista- † Submitted January 17, 2021 – Accepted April 20, 2022. http://doi.org/10.56369/tsaes.4206 Copyright © the authors. Work licensed under a CC-BY 4.0 License. https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ISSN: 1870-0462. Authors ORCID = Javier Javier-Alva: https://orcid.org/0000-0002-4953-8165; Luis Álvarez-Bernaola: https://orcid: 0000-0002-6174-9870; Rocío Mayta-Obos: https://orcid.org/0000-0002-7800-1447; René Aguilar-Anccota: https://orcid.org/0000-0002-3965-6096; Ricardo Peña- Castillo: https://orcid.org/0000-0001-9366-4962; Roger Chanduví-García: https://orcid.org/0000-0002-6061-3007; David Lindo-Seminario: https://orcid.org/0000-0002-8767-5304; Arturo Morales-Pizarro: https://orcid.org/0000-0003-3966-6689 1 Tropical and Subtropical Agroecosystems 25 (2022): #086 Morales-Pizarro et al., 2022 patógeno” (días) y la antibiosis por el porcentaje de inhibición del crecimiento (PIC). Resultados: Se aislaron e identificaron: siete-cepas de Trichoderma spp. (raíz: Tr-1, Tr-2, Tr3, Tr-6; y rizósfera: Tr-4, Tr-5, Tr-7); seis-Bacillus spp. (raíz: Bac-4, Bac-5, Bac-6; y rizósfera: Bac-1, Bac-2, Bac-3); y dos-Streptomyces sp. (rizósfera: Act-1, Act-2). Los resultados de la CS evaluados con la escala de Bell demostraron a Tr-1, Tr-7, T.atv (Trichoderma atroviride) y T- 22 (Trichoderma harzianum) se ubicaron en la clase 1 frente a Lasiodiplodia theobromae y, todos los aislados se ubicaron en la clase 1 frente a Campylocarpon pseudofasciculare y Phaeoacremonium parasiticum. El TC de Trichoderma fue 2 días (L. theobromae) y 3 días (C. pseudofasciculare y P. parasiticum). En la antibiosis Tr-5 (Trichoderma) y Bac-3 (Bacillus) tuvieron el mayor PIC (>50%) frente a los patógenos. El aislado Act-2 (Streptomyces sp.) presentó PIC, >70% (L. theobromae), >40% (C. pseudofasciculare) y >30% (P. parasiticum). Implicaciones: El uso del control biológico en el manejo de enfermedades de la madera de la vid es una herramienta eficaz, y puede integrarse en una estrategia de manejo integrado de estas patologías. Conclusiones: Los aislados nativos Bac-3 (Bacillus spp.), Tr-5 (Trichoderma spp.), Act-2 (Streptomyces sp.) demostraron control in vitro frente a los patógenos L. theobromae, C. pseudofasciculare y P. parasiticum, patógenos asociados a enfermedades de la madera de la vid. Palabras clave: Antagonistas; biocontrol; hongos de madera de la vid; rizósfera; raíz; uva de mesa. INTRODUCCIÓN enfermedad de Petri, y la muerte regresiva (Claverie et al., 2020). La enfermedad del pie negro, es causada por La vid (Vitis vinifera L.) es uno de los frutales de los géneros; Cylindrocladiella, Neonectria, mayor interés comercial a nivel mundial, permite el Ilyonectria, Dactylonectria, Thelonectria, y desarrollo socio-económico en diferentes países, y su Campylocarpon, genera un gran interés e importancia importancia radica en la producción de vinos y en las primeras etapas del cultivo (Langenhoven et al., consumo fresco; desarrollándose en los hemisferios 2018). La enfermedad de Petri es causada por norte y sur (30º-50º Latitud norte y sur) (Gramaje et diferentes especies de Phaeoacremonium (P.) y al., 2018). Los principales países productores son: Phaeomoniella (Pa.), representa en la actualidad un China con 13.9 millones de toneladas (Mt), Italia 8.2 reto de manejo, debido a la dificultad de ubicación Mt, EE. UU. 6.5 Mt (FAO, 2019). Perú es el primer dentro los vasos xilemáticos de la planta (Battiston et exportador de uva de mesa a nivel mundial al., 2021). La muerte regresiva en vid es causada por (MINCETUR, 2022), y las principales regiones diferentes especies de Botryosphaeria y sus anamorfos productoras son; Ica con 177 mil toneladas (mt) y Piura tales como; Diplodia mutila, D. seriata, con 172 mt (Agraria, 2021). Sin embargo, este cultivo Neofusicoccum australe, N. parvum y Lasiodiplodia se ve seriamente amenazado por “las enfermedades theobromae, entre otros, causando chancros y necrosis fúngicas de la madera de la vid” (EMV), ocasionando en el tronco y/o brazos, así como, la desecación y importantes pérdidas económicas en la viticultura, muerte de la zona afectada (Gramaje et al., 2018). altos costos de producción, y aumento de la incidencia de EMV resultado de las intensas prácticas agrícolas Los objetivos de esta investigación fueron: i) aislar (Armengol et al., 2021). La búsqueda de nuevas microorganismos endófitos nativos procedentes de la alternativas para el control de EMV ha aumentado, raíz y rizósfera de la vid y ii) evaluar in vitro su debido al gran impacto negativo en el ambiente potencial como agentes de biocontrol contra L. (Karimi et al., 2020). Diferentes estudios han theobromae, C. pseudofasciculare y P. parasiticum. demostrado que los ingredientes activos de los agroquímicos afectan la flora y fauna microbiana en la MATERIALES Y MÉTODOS rizósfera, así también, generan la resistencia de los patógenos fúngicos (Dries et al., 2021). El control El presente trabajo de investigación se realizó durante biológico de los hongos patógenos responsables de las el 2015-2016 en el laboratorio “Agrexlabs” de la EMV está basado en el uso de microorganismos empresa “Vivero-Los viñedos”-Chincha y en el antagonistas de los géneros Trichoderma spp, Bacillus laboratorio de Fitopatología (Departamento de spp, Streptomyces sp. (Gramaje et al., 2018; Dries et Sanidad Vegetal)-Facultad de Agronomía-Universidad al., 2021). Esta alternativa está siendo usada en la Nacional de Piura-Piura. protección de heridas de poda y tratamientos foliares enfocados a reducir la incidencia de las EMV (Gramaje Selección y recolección de muestras et al., 2018; Dries et al., 2021). Por otra parte, los aislados bacterianos Bacillus mycoides, Burkholderia Se recolectaron muestras de 300 g de suelo de la cepacia y Paenibacillus riograndensis muestran rizósfera y raíces entre los 20-30 cm de profundidad en características de control in vitro e in vivo, mediante la diferentes zonas productoras de vid en Piura (Tabla 1), producción de enzimas hidrolíticas (Bach et al., 2016). muestreando plantas más vigorosas, abundante sistema radicular, con los mejores registros de productividad. Las EMV causan el declive y/o la muerte temprana en Las muestras fueron colocadas en bolsas de papel kraf, plantas tanto en vivero como en campo (plantas etiquetas y almacenadas a 12ºC hasta su análisis en jóvenes menores a 5 años) como; pie negro, la laboratorio. 2 Tropical and Subtropical Agroecosystems 25 (2022): #086 Morales-Pizarro et al., 2022 Tabla 1. Aislamientos de antagonista fungosos y bacterianos de la raíz y rizósfera de diferentes Valles de Piura. Aislado Valle Variedad/patrón Zona Tr-7 San Lorenzo Red Globe/MGT 101-14 Rizósfera Tr-4 San Lorenzo Red Globe/Harmony Rizósfera Tr-5 Cieneguillo Red Globe/MGT 101-14 Rizósfera Tr-1 Cieneguillo Red Globe/MGT 101-14 Raíz Tr-3 Medio Piura Red Globe/MGT 101-14 Raíz Tr-2 Medio Piura Red Globe/MGT 101-14 Raíz Tr-6 Cieneguillo Red Globe/Harmony Raíz Act-1 Alto Piura Red Globe/Harmony Rizósfera Act-2 Cieneguillo Red Globe/MGT 101-14 Rizósfera Bac-1 Alto Piura Red Globe/MGT 101-14 Rizósfera Bac-2 Medio Piura Red Globe/MGT 101-14 Rizósfera Bac-3 Cieneguillo Red Globe/MGT 101-14 Rizósfera Bac-4 Cieneguillo Red Globe/MGT 101-14 Raíz Bac-5 Medio Piura Red Globe/MGT 101-14 Raíz Bac-6 San Lorenzo Red Globe/Harmony Raíz Aislamiento de microorganismos antagonistas de la conidióforos e hifas (Barnett y Hunter, 1972; Romero- rizosfera Cortes et al., 2019). En bacterias, se identificaron mediante observaciones morfológicas de la colonia y Se pesó 1 g de muestra de suelo (rizósfera) y se colocó microscópica comparadas con lo descripto por Bergey en tubos de ensayo conteniendo 9 ml de agua destilada et al. (2000). estéril, con ayuda de un agitador magnético vortex- genie se homogenizó la muestra. Se hicieron Prueba in vitro de aislados nativos frente a hongos diluciones seriadas 10-2 y 10-3 (hongos) y 10-4 y 10-5 de la madera de la vid (bacterias) extrayendo una alícuota de 0.1 ml colocándolo en una placa de Petri con medio PDA En hongos, se utilizaron los aislados nativos con ocho (papa dextrosa agar) con 50 mg tetraciclina días de incubación, y fueron comparados con tres (antibiótico) para hongos y sin tetraciclina para aislados comerciales; T. harzianum (T-22 y Trnai) y T. bacterias, se incubó durante 3 días (bacterias) y 5 días atroviride (T.atv), para evaluar su control en cultivos (hongos) a 28 ± 1°C, se usó la metodología de Delgado duales contra L. theobromae (10 días de incubación), y Javier (1991) con modificaciones en el antibiótico y C. pseudofasciculare y P. parasiticum (20 días de el tiempo de incubación de los microorganismos. incubación) procedentes de la micoteca del laboratorio Agrex Labs. Aislamiento de microorganismos endófitos de la raíz Se estudiaron los mecanismos de antagonismo: competencia por sustrato y antibiosis (Calvo et al., Se cortaron segmentos de raíces (0.2x0.8 cm), 2012). En la competencia por sustrato se estudiaron sumergiéndose en alcohol (70%) durante 5 segundos, dos variables: I) Ubicación en la escala de clases de posteriormente fueron colocadas en papel toalla estéril Bell et al. (1982); clase 1, el antagonista cubre para su secado; con ayuda de una pinza y un bisturí, se completamente al patógeno; clase 2, el antagonista colocó 10 segmentos (0.2x0.2 cm) por placa con PDA sobrepasa las ⅔ partes del medio de cultivo; clase 3, el (3 repeticiones por muestra). Se incubó durante 3 días antagonista y patógeno, cada uno ocupa la mitad del (bacterias) y 5 días (hongos) a 28±1°C, realizándose la medio de cultivo; clase 4, el patógeno coloniza las ¾ selección y purificación de los aislados en medio PDA. partes de la caja Petri; clase 5, el patógeno cubre Se usó la metodología de Delgado y Javier (1991) con completamente al antagonista. II) Tiempo de contacto modificaciones para este estudio (tiempo de inmersión antagonista-patógeno (días) (Calvo et al., 2012). La de las raíces en alcohol 70% durante 5 segundos). antibiosis se midió mediante el “Porcentaje de inhibición del crecimiento” (PIC). Se calculó el PIC Identificación de hongos y bacterias bajo la fórmula de Ezziyyani et al. (2004) donde PIC=[(C1-C2) /C1]*100, donde C1 se refiere al En hongos, se observaron las características “crecimiento radial del testigo” (patógeno sin morfológicas de las colonias: color anverso y reverso, antagonista) y C2 el “crecimiento radial del patógeno” tasa de crecimiento, textura, color, y topografía en en los tratamientos, realizando 3 repeticiones por medio PDA, y características microscópicas: conidios, tratamiento. 3 Tropical and Subtropical Agroecosystems 25 (2022): #086 Morales-Pizarro et al., 2022 En bacterias, se utilizaron los aislados bacterianos y un cabezuelas aparentemente húmedas, y pulverulentas aislado comercial (Bcnai-B. subtilis). Se realizó con diámetro de 3-6μm (Tabla 2). El aislado Tr-7 cultivos duales frente a L. theobromae, C. presentó la mayor tasa de crecimiento con 20.1±0.2 pseudofasciculare y P. parasiticum, y se calculó PIC mm/día (Tabla 3). propuesto por Ezziyyani et al. (2004) con modificaciones para este estudio en el enfrentamiento Identificación de bacterias antagonistas dual; aislado fúngico-patógeno (3 cm) y aislado bacteriano-patógeno (2 cm). Se identificó en AN, el género Bacillus spp., con un color de la colonia crema, consistencia varía desde Análisis estadístico cremosa a seca, forma irregular, bordes aserrados, superficie opaca y elevación plana. Bacilos Gram Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) con un positivos formadores de endosporas en el centro, nivel de significancia de p < 0.05 y comparación de células bacterianas móviles y crecimiento a 50ºC. medias mediante la prueba de diferencias de media significativa (LSD) de Fisher. Se usó el paquete Así también, se identificó el género Streptomyces sp. estadístico Stagraphics versión 19. por el color de la colonia beige, consistencia seca pulverulenta, forma irregular, borde ondulado, RESULTADOS superficie rugosa, bacilos filamentosos y Gram positivos, formación de endosporas, y no móviles. Aislamiento de hongos y bacterias antagonista Prueba in vitro por Hongos De la raíz, se aislaron cuatro antagonistas fungosos (Tr-1, Tr2, Tr-3, Tr-6) y tres bacterianos (Bac-4, Bac- En la prueba de cultivos duales evaluados con la escala 5, Bac-6). De la rizósfera, se aislaron tres antagonistas de Bell et al. (1982), los aislados Tr-1, Tr-7, T.atv y T- fungosos (Tr-4, Tr-5, Tr-7) y cinco bacterianos (Act-1, 22 se ubican en la clase 1 frente a L. theobromae Act-2, Bac-1, Bac-2, Bac-3). (Tabla 1). cubriendo por completo la colonia a los 4 días después de la siembra siendo estadísticamente similares, los Identificación de hongos antagonistas demás aislados se ubicaron en la clase 2. En las pruebas duales frente a C. pseudofasciculare y P. parasiticum Se identificó mediante características típicas el género los aislados antagonistas se ubicaron en la clase 1 Trichoderma spp. en medio PDA, las colonias fúngicas siendo estadísticamente similares entre sí, 4 días presentaron una variación de color verde claro, oscuro después de la siembra (Tabla 3). y brillante, variación de la textura de algodonosa y granular. A nivel microscópico las hifas septadas, En el tiempo de contacto, los antagonistas entraron en anchas, rectas, angostas (relativamente). Los contacto con L. theobromae a los 2 días después de la conidióforos son hialinos, verticales, no verticilados, siembra no presentando diferencias significativas. Sin eje principal ramificado (forma irregular y piramidal). embargo, frente a C. pseudofasciculare y P. Las esporas asexuales o conidias son hialina a verdes, parasiticum entraron en contacto a los 3 días después unicelulares, ovoides y/o elipsoidales, acumuladas en de la siembra (Tabla 3). Tabla 2. Características morfológicas de los aislados antagonistas fungosos. Aislado Color Topografía Margen Textura Hifa Conidióforo Conidia Tr-1 Verde Aplanada Entero Granular Septada Hialino, ramificado, Hialina, unicelular, brillante no verticilado ovoide Tr-2 Verde Aplanada Entero Granular Septada Hialino, ramificado, Hialina, unicelular, oscuro no verticilado ovoide Tr-3 Verde Aplanada Entero Granular Septada Hialino, ramificado, Hialina, unicelular, brillante no verticilado ovoide Tr-4 Verde Aplanada Entero Algodonosa Septada Hialino, ramificado, Hialina, unicelular, oscuro y granulada no verticilado ovoide Tr-5 Verde Aplanada Entero Algodonosa Septada Hialino, ramificado, Hialina, unicelular, oscuro y granulada no verticilado ovoide Tr-6 Verde Aplanada Entero Granular Septada Hialino, ramificado, Hialina, unicelular, claro no verticilado ovoide Tr-7 Verde Aplanada Entero Granular Septada Hialino, ramificado, Hialina, unicelular, claro no verticilado ovoide 4 Tropical and Subtropical Agroecosystems 25 (2022): #086 Morales-Pizarro et al., 2022 Tabla 3. Escala de Bell y tiempo de contacto (T.C) de Trichoderma spp. frente a los hongos de la madera de la vid. L. theobromaeae C. pseudofasciculare P. parasiticum Aislado T.cr1 (mm/día) E.B5 T.C E.B5 T.C E.B5 T.C Trnai2 13.4±0.1 c 2.0 b 2.0 a 1.0 a 3.0 a 1.0 a 3.0 a Tr-4 13.4±0.1 c 2.0 b 2.0 a 1.0 a 3.0 a 1.0 a 3.0 a Tr-6 13.7±0.2 b 2.0 b 2.0 a 1.0 a 3.0 a 1.0 a 3.0 a Tr-7 20.1±0.2 a 1.0 a 2.0 a 1.0 a 3.0 a 1.0 a 3.0 a Tr-3 13.4±0.1 c 2.0 b 2.0 a 1.0 a 3.0 a 1.0 a 3.0 a Tr-2 13.4±0.1 c 2.0 b 2.0 a 1.0 a 3.0 a 1.0 a 3.0 a Tr-5 13.5±0.2 bc 2.0 b 2.0 a 1.0 a 3.0 a 1.0 a 3.0 a T-223 13.5±0.3 bc 1.0 a 2.0 a 1.0 a 3.0 a 1.0 a 3.0 a T.atv4 13.6±0.1 c 1.0 a 2.0 a 1.0 a 3.0 a 1.0 a 3.0 a Tr-1 13.3±0.1 c 1.0 a 2.0 a 1.0 a 3.0 a 1.0 a 3.0 a 1Tasa de crecimiento, 2,3T. harzianum, 4T. atroviride (T.atv), 5Escala de Bell et al. (1982) *Letras diferentes indican diferencias estadísticas. Porcentaje de Inhibición de crecimiento - PIC por hongos Tabla 5. Porcentaje de inhibición del crecimiento de aislados bacterianos. Los aislados T.atv (59.4%), Tr-3 (57.7%) y Tr-5 L. theo- C. pseudo- P. para- Aislado (54.4%) alcanzaron el mayor PIC frente L. theobromae bromae fasciculare siticum siendo estadísticamente similares entre sí y superiores Act-1 71.0 a 45.5 b 33.0 d a los demás aislados. Los aislados Tr-1, Tr-2, Tr-5, Tr- Act-2 72.5 a 51.5 b 40.4 c 6, Tr-7, Trnai y T.atv presentaron mayor PIC siendo Bac-1 66.5 bc 53.8 ab 47.7 b superior a 75.6% frente C. pseudofasciculare. Los Bac-2 68.0 b 61.4 a 40.4 c aislados Tr-5, Tr-7 y T-22 presentaron PIC mayor a Bac-3 71.5 a 59.1 a 62.4 a 71.4% frente a P. parasiticum (Tabla 4) (Figura 1). Bac-4 63.5 de 52.3 ab 43.1 bc Bac-5 61.5 e 46.2 b 33.0 d Bac-6 65.5 cd 56.8 ab 42.2 bc Tabla 4. Porcentaje de Inhibición de crecimiento Bcnai* 55.5 f 51.5 b 44.0 bc (PIC) de los aislados fungosos. *Aislado comercial: B. subtilis (Bcnai); *Letras diferentes L. theo- C. pseudo- P. para- indican diferencias estadísticas. Aislado bromae fasciculare siticum Tr-2 37.8 d 82.1 ab 71.4 c Tr-6 40.3 cd 82.1 ab 71.4 c DISCUSIÓN T-221 42.0 cd 79.5 bc 85.7 a Tr-1 42.0 cd 82.1 ab 76.2 b Perú se convertido en el primer exportador de uva de Trnai2 42.0 cd 80.7 ab 71.4 c mesa (MINCETUR, 2022). Así también, en Perú se ha Tr-7 46.1 c 83.3 ab 85.7 a reportado P. parasiticum afectando el crecimiento y Tr-4 47.8 bc 75.6 c 71.4 c desarrollo de vides jóvenes (4-8 meses) (Romero- Tr-5 54.4 ab 84.6 a 85.7 a Rivas et al., 2009). El incremento de áreas cultivadas Tr-3 57.7 a 79.5 bc 71.4 c y prácticas de manejo agronómico con el fin de T.atv3 59.4 a 80.7 ab 71.4 c aumentar la producción, han originado un incremento 1,2T. harzianum (T-22 y Trnai) y 3T. atroviride (T.atv) importante de las EMV (Gramaje et al., 2018; Dries et *Letras diferentes indican diferencias estadísticas. al., 2021). Las estrategias en el manejo EMV están basadas en el reducido número de moléculas activas y en las prácticas culturales del cultivo (Battiston et al., Prueba in vitro por Bacterias 2021; Dries et al., 2021), lo que ha incrementado la incidencia EMV en campo y vivero (Silva-Valderrama Los aislados Act-1 (71%), Bac-3 (71.5%) y Act-2 et al., 2021). Las restricciones de materias activas en (72.5%), presentaron el mayor PIC frente a L. mercados externos, ha hecho necesario incrementar el theobromae siendo estadísticamente similares entre sí. número alternativas para ser frente a los patógenos de Por otro lado, los aislados Bac-2 (61.4%) y Bac-3 las EMV, por esta razón, el control biológico puede ser (59.1%) presentaron mayor PIC frente a C. incorporado en una viticultura sostenible (Dries et al., pseudofasciculare por encima de 45.5%. El aislado 2021). Bac-3 presentó el mayor (PIC), superior a 33.0% frente a P. parasiticum (Tabla 5) (Figura 1). 5 Tropical and Subtropical Agroecosystems 25 (2022): #086 Morales-Pizarro et al., 2022 A B C D E F G H I J K L Figura 1. Prueba in vitro de aislados nativos frente “hongos de la madera de la vid”. Trichoderma frente A) L. theobromae, B) C. pseudofasciculare, C) P. parasiticum; Bacillus frente D) L. theobromae, E) C. pseudofasciculare, F) P. parasiticum; Streptomyces sp. frente G) L. theobromae, H) C. pseudofasciculare, I) P. parasiticum.; colonia de patógenos J) L. theobromae, K) C. pseudofasciculare, L) P. parasiticum. Los aislados Tr-1, Tr2, Tr-3, Tr-4, Tr-5, Tr-6, Tr-7 Asimismo, se identificaron seis aislados del género fueron identificados como Trichoderma spp. mediante Bacillus spp. y dos Streptomyces sp., estas observaciones morfológicas y microscópicas descripciones corresponden a las mencionadas por coincidiendo con las claves descritas por Barnett y Bergey et al. (2000). Los 10 aislados fungosos (7 cepas Hunter (1972) y Romero-Cortes et al. (2019). nativas y 3 cepas comerciales) en la escala de Bell et 6 Tropical and Subtropical Agroecosystems 25 (2022): #086 Morales-Pizarro et al., 2022 al. (1982) frente a C. pseudofasciculare y Microorganismos biocontroladores como Phaeoacremonium parasiticum, se ubicaron en la clase alternativa de manejo de EMV 1, asimismo, Tr-1, T.atv y T-22 frente a L. theobromae se ubicaron en la clase 1. Resultados similares fueron El manejo de una viticultura sostenible empieza a obtenidos por Garrido y Vilela (2019) con tomar mayor importancia, y en especial por la salud del Trichoderma harzianum frente a los fitopatógenos suelo y su interacción planta-microorganismos en la Rhizoctonia solani, R. oryzae-sative, R. oryzae y rizósfera (Dries et al., 2021), mejorando su calidad, Nakatea sigmoidea se ubican en la clase 1. Sin fertilidad y la supresión de patógenos influyendo embargo, frente a Sclerotium rolfsii se ubica en la clase directa o indirectamente en la productividad de los 3. Andrade-Hoyos et al. (2020) ubicaron T. asperellum cultivos (Karimi et al., 2020; Aguilar-Anccota et al., (T-AS6), T. harzianum (T-H3) y T. koningiopsis (T- 2021; Dries et al., 2021). K8 y T-K11) en la clase 1 frente a Phytophthora cinnamomi, mientras que T. harzianum (T-H4 y T-H5), Trichoderma ha demostrado un control directo de los T. hamatum (T-A12) y T. asperellum (T-AS1) en la patógenos de la madera de la vid, así también, es un clase 2 frente al P. cinnamomi. Así también, T. promotor de crecimiento y activador de los genes de harzianum y T. viride colonizaron y esporularon sobre resistencia de las plantas (Stempien et al., 2020). colonias de R. solani (Aguilar-Anccota y Mattos- Además, Trichoderma T154 tiene un comportamiento Calderón, 2020). endófito colonizando haces vasculares y reduciendo la colonización Phaeoacremonium minimum (Carro- Todos los aislados entraron en contacto con L. Huerga et al., 2020). Las pruebas in vitro han theobromae a los 2 d, respecto a C. pseudofasciculare demostrado controlar patógenos como; Phomopsis y P. parasiticum, tuvieron contacto a los 3 d. Guédez viticola, Pa. chlamydospora, Eutypa lata, anamorfos et al. (2012) demostraron que Trichoderma entra en de Botryosphaeria (Kotze et al., 2011), en vivero en la contacto con R. solani, S. rolfsii y F. oxysporum a los etapa de injertación ha controlado a los patógenos; P. dos y tres días de su enfrentamiento, así también, minimum y Pa. chlamydospora. En campo, Mutawila indican que un menor tiempo de contacto, es un et al. (2016) mencionan que el periodo óptimo para indicador de una mayor agresividad. inocular Trichoderma es de 6 horas posterior a la poda, obteniendo buenos resultados en la colonización de El PIC en hongos, Tr-5, Tr-3 y T.atv frente a L. haces vasculares. Carro-Huerga et al. (2020) theobromae fueron superiores con 54.4%, 57.7% y comentaron que cepas nativas de Streptomyces 59.4% respectivamente. Tr-5 frente a C. (Actinomicetos) reducen los síntomas de las EMV en pseudofasciculare, mostro el mayor PIC con 84.6%. vid jóvenes causado por Dactylonectria sp., P. Tr-5, Tr-7 y T-22 presentaron PIC superior a 71.4% minimum y Pa. chlamydospora. Paraburkholderia frente a Phaeoacremonium parasiticum. Wanjiku et al. phytofirmans (PsJN) (bacteria endófita) coloniza haces (2021) obtuvieron PIC de 54.57% de T. harzianum vasculares de un amplio rango de plantas, promueve el frente a L. theobromae. Así también, Bhadra et al. crecimiento e induce la resistencia de plantas frente a (2014) mencionan que aislados de Trichoderma spp. los estreses biótico y abiótico (Esmaeel et al., 2018). tienen PIC entre el 60 a 75% a 28±2ºC confrontados Asimismo, la aplicación en conjunto de fenpiclonil con L. theobromae. Diferentes aislados de (fungicida) y PsJN sobre los tejidos vasculares de vid, Trichoderma spp. presentan diferentes PIC frente a L. ha inducido la resistencia de la planta frente a theobromae y C. pseudofasciculare, debido a sus Neofusicoccum parvum, patógeno relacionado con la distintos mecanismos de control (Hernández et al., muerte regresiva de Botryosphaeria (Wu et al., 2020). 2016). El PIC en bacterias, Act-1, Bac-3 y Act-2 frente a L. theobromae presentaron los mayores valores con CONCLUSIONES 71%, 71.5% y 72.5% respectivamente. Bac-2 (61.4%) y Bac-3 (59.1%) frente a C. pseudofasciculare Los aislados nativos Bac-3 (Bacillus spp.), Tr-5 presentaron el mayor PIC. Tr-5, Tr-7 y T-22 (Trichoderma spp.), Act-2 (Streptomyces sp.) presentaron el mayor PIC con 85.7% frente a P. demostraron control in vitro frente a los patógenos parasiticum. Borges et al. (2018) indican que Bacillus Lasiodiplodia theobromae, Campylocarpon spp. (UnB1366) inhibió significativamente el pseudofasciculare y Phaeoacremonium parasiticum crecimiento de L. theobromae en un 45.5%. Jiménez et obteniendo resultados similares y/o superiores a al. (2018) demostraron que B. subtilis y B. aislados comerciales Trichoderma harzianum (T-22 y licheniformis inhibieron el crecimiento de Venturia Trnai), Trichoderma atroviride (T.atv) y Bacillus inaequalis en un 33% y 41.3% respectivamente. Los subtilis (Bcnai). El biocontrol es usado tanto en vivero actinomicetos (Streptomyces spp) presentan altos como campo para el manejo EMV, aplicados (suelo, niveles de inhibición: cepa APC70 contra Alternaria heridas de poda, foliar) solos o combinados con otros spp. (57,6%), cepa AAH53 contra Rhizoctonia spp. biocontroladores, foliares nutricionales y fungicidas. (53.08%), y cepa AAH53 contra Fusarium spp. (49.36%) (Dávila et al., 2013). 7 Tropical and Subtropical Agroecosystems 25 (2022): #086 Morales-Pizarro et al., 2022 Agradecimiento scajamar/public/pdf/series- Al ing. Juan Munive Olivera, gerente de la empresa tematicas/informes-coyuntura- “Vivero-Los viñedos”-Chincha, Perú, por su apoyo monografias/el-sector-vitivinicola-frente- logístico. al.pdf. Andrade-Hoyos, P., Silva-Rojas, H. V. and Romero- Funding. All authors declare not having received any Arenas, O., 2020. Endophytic Trichoderma funding in the development of our research. Species Isolated from Persea americana and Cinnamomum verum Roots Reduce Conflict of interest. All authors declare not having Symptoms Caused by Phytophthora any conflict of interest in this article that has affected cinnamomi in Avocado. Plants, 9(9), pp. the performance of the same. 1220. https://doi.org/10.3390/plants9091220. Compliance with ethical standards. Do not apply Bach, E., dos Santos Seger, G. 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