Manual de micropropagación del yacón (Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson) Ministerio de Agricultura y Riego MINISTERIO DE AGRICULTURA Y RIEGO INSTITUTO NACIONAL DE INNOVACIÓN AGRARIA DIRECCIÓN DE RECURSOS GENÉTICOS Y BIOTECNOLOGÍA - DRGB Proyecto 092_PI “Variación del contenido de fructooligosacáridos (FOS) en accesiones promisorias de yacón: caracterización, clonamiento y análisis funcional de un fragmento de ADN complementario de la hidrolasa responsable de su degradación”. Manual de micropropagación del yacón (Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson) Ministerio de Agricultura y Riego Editor general: Ministro de Agricultura y Riego Eliana Alviárez Gutierrez, M.Sc. Ing. Jorge Luis Montenegro Chavesta Revisión de contenido: Viceministro de Desarrollo e Infraestructura Agraria y Riego Betty Flores Gonzales 1. Introducción 3 Econ. Carlos Alberto Ynga La Plata Heillen Calderón Castillo 2. Fases de la micropropagación de yacón 6 Gabriela Salazar Alvarez Viceministra de Políticas Agrarias 2.1. FASE 0: Acondicionamiento de la planta madre 6 Econ. Paula Rosa Carrión Tello Diseño y diagramación: 2.2. FASE 1: Establecimiento o Iniciación 8 Abner Fernando Mio Torrejón Jefe del INIA Luis Carlos Arévalo Mercado 2.3. FASE 2: Multiplicación 11 Jorge Luis Maicelo Quintana, Ph. D. Jeams López Acaro 2.4. FASE 3: Enraizamiento 12 © Instituto Nacional de Innovación Agraria – INIA Publicado: 2.5. FASE 4: Aclimatación 13 Proyecto 092_PI diciembre, 2019 3. Glosario 17 “Variación del contenido de fructooligosacáridos (FOS) Primera Edición: 4. Referencias 18 en accesiones promisorias de yacón: caracterización, diciembre, 2019 clonamiento y análisis funcional de un fragmento de 5. Anexo 19 ADN complementario de la hidrolasa responsable de su Tiraje: degradación”. 2000 ejemplares Elaboración de contenido: Impreso en: Blga. Rosa Maria Cabrera Pintado Nombre de la imprenta: Vayu advertising Blga. Jérica Danae Aliaga Cóndor & communications S.A.C. RUC: 20604037361 Equipo técnico: Teléfono: 964389548 Blga. Rosa María Cabrera Pintado Dirección: De los ingenieros Nro. 110 Dpto. 102 Blga. Delia Castro San Miguel Urb. Valle Hermoso Lima - Lima - Santiago de Surco Blga. Jérica Danae Aliaga Cóndor E-mail: ventas@vayucomunicaciones.com Editado por: ISBN: Instituto Nacional de Innovación Agraria - INIA 978-9972-44-041-0 Equipo Técnico de Edición y Publicaciones Av. La Molina 1981, Lima - Perú (51 1) 240-2100 / 240-2350 www.inia.gob.pe Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú N° 2019-18933 Prohibida la reproducción de este libro por cualquier medio, total o parcialmente, sin permiso expreso. 1. Introducción El yacón (Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson) es una especie de la familia Asteraceae originaria de la región andina (Robinson mencionado por Mansilla, et al., 2010). Su cultivo está registrado desde la época precolombina y ha permanecido por mucho tiempo restringido a áreas muy pequeñas por estar adaptada a las condiciones ecológicas de los Andes (Mansilla et al., 2010). El yacón ha generado interés mundial debido a sus propiedades promisorias (Seminario, Valderrama y Manrique, 2003), permitiendo aumentar su uso potencial en la agroindustria e industria farmacéutica; debido a la presencia de compuestos fenólicos y fructooligosacáridos (FOS), que se encuentran almacenados en la raíz y cuyos contenidos pueden variar dependiendo de la variedad, el ambiente y su interacción (Manrique, Gonzales, Valladolid, Blas y Lizárraga, 2014). La propagación del yacón para fines de producción es únicamente vegetativa o asexual debido a que sus semillas sexuales presentan alta esterilidad (Manrique et al., 2014). Este tipo de propagación posibilita la transmisión de enfermedades, especialmente las causadas por virus y bacterias y a la vez limita las posibilidades de mejoramiento de la especie cultivada (Salvarrey, 2008). Una alternativa para disponer de material vegetal de propagación para multiplicación es el uso de la técnica de micropropagación, que consiste en la propagación asexual de plantas a partir del cultivo de tejidos vegetales en un ambiente artificial controlado, empleando medios de cultivo adecuados para cada una de las fases desarrolladas en condiciones in vitro. Una de las ventajas de esta técnica es obtener plantas libres de bacterias, hongos, virus y nemátodos. Como parte de los resultados del Proyecto 092_PI: Variación del contenido de fructooligosacáridos (FOS) en accesiones promisorias de yacón: Caracterización, clonamiento y análisis funcional de un fragmento de ADN complementario de la hidrolasa responsable de su degradación, se ha elaborado el presente manual que describe el protocolo para la micropropagación de yacón, obtenido como resultado de una de las investigaciones desarrolladas en el marco del proyecto. Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para la micropropagación del yacón 2. Fases de la micropropagación de yacón Para la micropropagación del yacón se requiere cumplir con las siguientes fases: 2.1. FASE 0: Acondicionamiento de la planta madre Esta fase también es conocida como acondicionamiento de la planta stock. Se desarrolla en condiciones de invernadero o casa malla. Consiste en regenerar plantas provenientes de rizóforos (Figura 1), que son las estructuras de propagación convencional del yacón. A B Figura 1. Rizóforos de yacón. C Las plantas madre (Figura 2) deben estar contenidas en macetas con sustrato Figura 2. Acondicionamiento de las plantas madres de yacón. (A) Brotación de rizóforos. (B) Crecimiento de las plantas Premix N° 8 y regadas de acuerdo a los requerimientos hídricos. El riego debe ser madre. (C) Plantas madre de yacón mantenidas en invernadero. directamente al sustrato, a fin de evitar el desarrollo de hongos en el follaje cercano a las yemas que serán usadas como explantes. Se recomienda aplicar un fungicida sistémico al sustrato una semana antes de la colecta de explantes, con el fin de disminuir la carga de patógenos endófitos. 6 7 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para la micropropagación del yacón 2.2. FASE 1: Establecimiento o Iniciación Una vez que las plantas regeneradas tienen un tamaño al menos de 15 cm de altura; extraer los explantes, que en este caso vienen a ser las yemas apicales y axilares (Figura 3). A partir de las yemas apicales se puede disectar posteriormente los meristemas para iniciar el cultivo in vitro. Figura 5. Lavado de muestras bajo agua de grifo. A B C Colocar las yemas en una solución de benomil al 0.1 % (P/V) durante una hora. Transcurrido ese tiempo proceder a enjuagar con agua de grifo hasta eliminar los Figura 3. Explantes para la introducción in vitro. (A) yema apical, (B) axilar y (C) meristema aislado. restos de fungicida. Posteriormente realizar la desinfección superficial en condiciones Con tijeras estériles cortar las yemas, colocarlas en un frasco (Figura 4), luego llevarlas estériles en cámara de flujo laminar (Figura 6). al laboratorio y lavarlas con abundante agua de grifo y jabón líquido (Figura 5). A B A B Figura 4. Procesamiento de yemas apicales. (A) Corte de yema apical. (B) Frascos de vidrio conteniendo yemas. Figura 6. Desinfección de yemas de yacón. (A) Muestras listas para la desinfección superficial. (B) Inicio del proceso de desinfección. 8 9 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para la micropropagación del yacón Pasos a seguir para la desinfección superficial: Posteriormente, los meristemas y/o yemas deben ser incubados durante dos semanas a 21 °C bajo penumbra, seguido de exposición a luz con fotoperiodo de 16 a. Sumergir las muestras en alcohol (70 %) por 1 minuto. horas durante dos semanas (Figura 8). b. Remojar las muestras en una solución de NaClO (1 %) más dos gotas de tween 20 durante 15 minutos. c. Finalmente, enjuagar tres veces con agua destilada estéril. Luego de la desinfección disectar las yemas apicales (con 2-4 primordios foliares) usando pinzas y bisturí, bajo un microscopio estereoscópico (40X). Una vez aislada la yema, se siembra en tubos de ensayo conteniendo el medio de cultivo Murashige y Skoog–MS (1962) más carbón activado y agar a pH 5.7 ± 0.01 (Anexo). Si es de interés sembrar meristemas, se deberá continuar la disección de las yemas hasta dejar solo dos primordios foliares y el domo meristemático (Figura 7). Figura 8. Yemas de yacón luego de dos semanas de la siembra. 2.3. FASE 2: Multiplicación Transcurrido el periodo indicado para el establecimiento in vitro, las yemas regeneradas (Figura 9A) se subcultivan al medio MS más carbón activado y agar a pH 5.7 ± 0.01 (Anexo) para la formación de brotes axilares, donde permanecerán durante 30 días, que es el periodo de tiempo para realizar los subcultivos. A B En esta fase se deben usar microesquejes con las yemas apicales o axilares. Usando Figura 7. Aislamiento de meristema. (A) Disección de meristema usando microscopio estereoscópico. (B) Meristema de yacón este protocolo la tasa de multiplicación promedio es de 3.1 microesquejes cada 30 (en círculo rojo). días (Aliaga, 2017). 10 11 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para la micropropagación del yacón Figura 10. Plántulas enraizadas listas para ingresar a la fase de aclimatación. A B 2.5. FASE 4: Aclimatación Figura 9. Desarrollo de la yema de yacón. (A) Yema regenerada luego de la etapa de establecimiento. (B) Yema en desarrollo durante la fase de multiplicación. Las vitroplantas deben retirarse de los tubos o frascos que las contienen y lavarse cuidadosamente con agua potable hasta quitar los residuos de agar, para luego 2.4. FASE 3: Enraizamiento sembrarlas en las pastillas jiffys #42H, las cuales deben hidratarse con agua destilada dos horas antes de su uso (Figura 11). El yacón es una especie que no requiere la adición de ningún inductor de formación de raíces, por lo que se usa el medio de cultivo carente de auxinas. Para lograr la aclimatación de las plántulas regeneradas a condiciones ex vitro, se debe disminuir poco a poco la humedad relativa y aumentar la intensidad luminosa. Durante esta fase se inducirá la formación de raíces en microesquejes de mínimo 2 En estas condiciones se logrará que las plántulas sean completamente autotróficas. cm de longitud. Para esto, se deben seccionar los microesquejes apicales y sembrar en medio de cultivo MS más carbón activado y agar a pH 5.7 ± 0.01 (Anexo). Esta fase se desarrolla en invernadero o en fitotrón, con una temperatura de 21 ± 2 °C, fotoperiodo de 16 horas de luz y 70 % de humedad relativa. Luego de 30 días se observará la formación de un adecuado número de raíces y las plántulas estarán listas para entrar al periodo de aclimatación (Figura 10). 12 13 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para la micropropagación del yacón Plántulas para aclimatar Hidratar las pastillas jiffys 2 horas antes de uso a. Extraer las plántulas de los tubos. b. Lavar las plántulas. c. Sembrar las plántulas en los jiffys. d. Colocar los jiffys con las plántulas en el fitotrón. Figura 11. Proceso de aclimatación de plántulas de yacón. Continuación del proceso de aclimatación de plántulas de yacón. 14 15 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para la micropropagación del yacón Las plántulas deben mantenerse en el fitotrón hasta terminar la fase de aclimatación. 3. Glosario En el caso del yacón esta fase es bastante corta, puesto que en 3 semanas se tendrán las plántulas de yacón totalmente aclimatadas a condiciones ex vitro. · Explante: cualquier parte de la planta con la cual se inicia el cultivo in vitro. Al terminar esta etapa, las plántulas están listas para su trasplante a bolsas o macetas · Fitotrón: cámara climática para crecimiento de plantas. y pasar a mantenimiento en condiciones de vivero, donde se desarrollarán hasta tener 15 cm de altura, para finalmente ser trasplantadas a campo (Figura 12). · Penumbra: condición donde se recibe poca luz. · Planta madre: planta donadora de explantes para iniciar el cultivo in vitro. · Rizóforos: estructuras de propagación vegetativa del yacón, conocidas comúnmente como cepas. · Vitroplantas: plántulas obtenidas por cultivo de tejidos vegetales. Figura 12. Plántulas de yacón aclimatadas para su mantenimiento en vivero. 16 17 Instituto Nacional de Innovación Agraria Manual para la micropropagación del yacón 4. Referencias 5. Anexo Aliaga, J.D. (2017). Micropropagación de dos accesiones de yacón (Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson) a partir de yemas apicales (Tesis de pregrado). Universidad Composición del medio básico de Murashige y Skoog (1962) para la Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú. micropropagación de yacón Mansilla, R., López, C., Flores, M. y Espejo, R. (2010). Estudios de la biología reproductiva en cinco accesiones de Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl) Robinson. Ecología Aplicada (Perú), 9(2), 167-175. Compuestos mg/l Manrique, I., Gonzales, R., Valladolid, A., Blas, R. y Lizárraga, L. (2014). Producción de semillas en yacón (Smallanthus sonchifolius (Poepp. &Endl)) mediante técnicas de polinización Macronutrientes controladas. Ecología Aplicada (Perú), 13(2), 135-145. NH4NO3 1650 Murashige, T. y Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco KNO3 1900 tissue cultures. Physiologia Plantarum 15:473-479. CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 Salvarrey, M.J. (2008). Evaluación de diferentes técnicas de propagación vegetativa en “guayabo KH2PO4 170 del país” (Acca sellowiana (Berg.) Burret) (Tesis de pregrado). Universidad de la República de Montevideo, Montevideo, Uruguay. Micronutrientes Seminario, J., Valderrama, M. y Manrique, I. (2003). El yacón: Fundamentos para el KI 0.83 aprovechamiento de un recurso promisorio. Lima, Perú: Centro Internacional de la Papa H3BO3 6.20 (CIP), Universidad Nacional de Cajamarca, Agencia Suiza papa el Desarrollo y Cooperacion MnSO4.4H2O 22.30 (COSUDE). ZnSO4.7H2O 8.60 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Na2EDTA 37.30 FeSO4.7H2O 27.80 Sacarosa 30000.00 Carbón activado: 100 mg/l Agar: 7 g/l pH: 5.7 ± 0.01 18 19 Av. La Molina 1981, La Molina (51 1) 240-2100 / 240-2350 www.inia.gob.pe Ministerio de Agricultura y Riego