Revista de Investigaciones Altoandinas – Journal of High Andean Research 22(4), 338–342, octubre–diciembre 2020
ISSN: 2306-8582
eISSN: 2313-2957
DOI:https://doi.org/10.18271/ria.2020.195
Regeneración y enraizamiento de brotes
adventicios etiolados de cultivares de zarzamora
(Rubus sp.)
Regeneration and rooting of etiolated adventitious shoots of
blackberry (Rubus sp.) cultivars
Carlos Eduardo Millones Chanamé1* y Ernestina Rosario Vásquez Castro2
Abstract
The objective of the present study was to evaluate the etiolated adventitious shoot regeneration for the development of an in vitro
propagation protocol of three Rubus sp. cultivars. Zygotic embryos were extracted from botanical seeds of Rubus sp. cultivars and
placed in establishment culture medium. After 90 days of in vitro culture, the seedlings were conditioned to obtain the basal stem
segments and placed in growth and development culture media, they were then subjected to periods of darkness for etiolated adventitious
shoot regeneration. Afterwards, the nodal segments were transferred to rooting culture media. Results showed that the regeneration of
adventitious shoots from Rubus sp. cultivars was on average eight days. Likewise, the sectioned nodal segments of the adventitious shoots
induced roots when the medium contained the combination of the auxins NAA and IBA. The regeneration of etiolated adventitious shoots
in the three cultivars of Rubus sp. allowed to obtain elongated shoots in a short time and without the use of growth regulators, facilitating
the in vitro propagation of this species.
Keywords: Rubus, regeneration, propagation, darkness.
Resumen
El objetivo de la presente investigación fue evaluar la regeneración de brotes adventicios etiolados para el desarrollo de un protocolo
de la propagación in vitro de tres cultivares de Rubus sp. Embriones cigóticos fueron extraídos de semillas botánicas de los cultivares
de Rubus sp. y colocados en medio de cultivo de establecimiento. A los 90 días de cultivo in vitro las plántulas fueron acondicionadas
para obtener los segmentos basales caulinares y colocadas en medios de crecimiento y desarrollo, luego fueron sometidos a periodos de
oscuridad para la regeneración de brotes adventicios etiolados. Posteriormente, los segmentos nodales fueron transferidos en medios de
cultivo de enraizamiento. Los resultados mostraron que la regeneración de los brotes adventicios en los cultivares de Rubus sp. fue en
promedio de ocho días, asimismo, los segmentos nodales seccionados de los brotes adventicios indujeron raíces cuando el medio contenía
la combinación de las auxinas ANA y AIB. La regeneración de brotes adventicios etiolados en los tres cultivares de Rubus sp. permitió
obtener brotes elongados en corto tiempo y sin el empleo de reguladores de crecimiento, facilitando la propagación in vitro de esta especie.
Palabras clave: Rubus, regeneración, propagación, oscuridad.
Recibido: 18/04/2020
Aceptado: 06/09/2020
Publicado: 01/10/2020
Sección: Artículo original
*Autor correspondiente: carlos.millones@untrm.edu.pe
Introducción Rubus incluye a citocininas y auxinas (Bueno et al.,
Rubus es uno de los géneros más diversos que pertenece 2018), citocininas y giberelinas (Cancino-Escalante et
a la familia Rosaceae, posee alrededor de 750 especies al., 2015; Millones, 2018; Pérez-Martínez Castañeda-
distribuidas en todos los continentes, excepto la Antártida Garzón, 2016). Además, para la elongación de los brotes
(Alice y Campbell, 1999). Actualmente, la propagación de R. ideaus ha sido empleado brasinolido, hormona
in vitro de Rubus sp. es considerada una alternativa vegetal de tipo esteroidal (Robres-Torres et al., 2015).
viable, con la finalidad de obtener plantas libres de virus, Por otro lado, la regeneración y elongación de
uniformidad genética y en menor tiempo (Clark y Finn,
1
2014). Departamento Académico de Educación, Ciencias de la Comunicación y CienciasBásicas, Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza de Amazonas, Perú.
Es así, que especies de Rubus son propagadas in vitro ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7236-6341.
empleando explantes como segmentos nodales (Ayub 2Departamento Académico de Educación, Ciencias de la Comunicación y Ciencias
et al., 2019; Da Silva et al., 2016; Hunková et al., Básicas, Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza de Amazonas, Perú.ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2106-7840.
2016; Pérez-Martínez y Castañeda-Garzón, 2016), brotes
(Hunková et al., 2016, 2018), y estacas de tallo con How to cite: Millones Chanamé, C.E. y Vásquez Castro, E.R. (2020).
yemas dormantes (Gajdošová et al., 2015). Regeneración y enraizamiento de brotes adventicios etiolados de cultivares dezarzamora (Rubus sp.). Revista de Investigaciones Altoandinas, 22(4), 338–342.
Asimismo, los reguladores de crecimiento empleados DOI: https://doi.org/10.18271/ria.2020.195.
para inducir una respuesta morfogénica en explantes de
Attribution 4.0 International (CC BY 4.0) Share - Adapt
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Millones Chanamé y Vásquez Castro
brotes adventicios etiolados in vitro, proporciona un Rubus sp. fue un diseño completamente al azar con
eficiente sistema para la multiplicación de especies de tres repeticiones y cinco submuestras, las medias fueron
importancia económica, por lo cual ha sido utilizada comparadas utilizando la prueba Tukey 0,05% de nivel
en la propagación in vitro, a partir de segmentos de de significación. Para el análisis de datos de la respuesta
hipocótilos, de Solanum melongena (Muktadir et al., morfogénica en los segmentos basales caulinares en cada
2016), y Ricinus communis (Zhang et al., 2016). Por cultivar de Rubus sp. versus el control, y el efecto de los
lo antes indicado, la presente investigación, tuvo como reguladores de crecimiento ANA y AIB en la inducción
objetivo evaluar la regeneración de brotes adventicios de raíces adventicias de brotes de Rubus sp, se empleó
etiolados para el desarrollo de un protocolo de la prueba t de dos medias con 0,05% de nivel de signi-
propagación in vitro de los cultivares Castilla, Tupy y ficación con 15 repeticiones. Los datos de las variables
Navaho Rubus sp. número de brotes, número de yemas por bro√te y número
de raíces, fueron transformados mediante la Y+0,5 an-
tes de someterlos al ANVA y/o prueba t. Todos los datos
Material y métodos fueron procesados empleando el paquete estadístico SAS
El material vegetal estuvo constituido por semillas botá- (Statistical Analysis System) for Windows V8.
nicas de Rubus sp. cultivares Castilla, Tupy y Navaho.
Para la obtención de segmentos basales caulinares, las
semillas fueron desinfectadas con HgCl 0,1% más 4 Resultados2
gotas de Tween20 por 15 minutos, posteriormente con Los embriones de los cultivares Castilla, Tupy y Navaho
ayuda de un estereoscopio fueron extraídos los em- germinaron a los nueve días de instalados in vitro (Figura
briones y colocados en tubos de ensayo con medio de 1a y 1b), y lasplántulas después de un periodo de 90
establecimiento (Millones, 2018), suplementado con 150 días de cultivo alcanzaron una longitud entre 60 a 70 mm
mg/L de ácido ascórbico, 0,1 mg/L de ácido giberélico (Figura 1c y d), y posteriormente fueron acondicionadas
(AG3), 0,04 mg/L de 6-furfurilaminopurina (KIN), phy- para la obtención de segmentos basales caulinares para la
tagel Sigma 0,15%, y pH ajustado a 5,8. Los embriones inducción de brotes adventicios etiolados (Figura 1e, f y
fueron incubados en cámara de crecimiento a 24 °C, g).
fotoperiodo 16/8h eirradiación 50 µmol m-2 s-1.
Plántulas de Rubus sp. germinadas fueron subculti-
vadas a medio de crecimiento y desarrollo a base de
las sales y vitaminas MS (Murashige y Skoog, 1962),
suplementado con mio-inositol 100 mg/L, sacarosa 3%,
18 mL/L de buffer fosfato, ácido ascórbico 150 mg/L y
phytagel Sigma 0,15%, pH ajustado a 5,8.
En la regeneración de brotes adventicios etiolados, se
emplearon las plántulasestablecidasen la etapa anterior,
con longitud de brotes de 60-70 mm y 90 días de cultivo.
El primer tratamiento de etiolación consistió en es-
cindir los 2/3 del brote aéreo, poda de raíz y escisión
de los limbos foliares. Posteriormente, los segmentos
basales caulinares fueron colocados en recipientes con
medio de crecimiento y desarrollo, envueltos con papel
aluminio, colocados en cámara de crecimiento a 24°C,
y sometidas a la primera etiolación por once días (1°
etiolación). Posteriormente, los brotes adventicios etiola-
dos regenerados fueron colocados en fotoperiodo 16/8h Figura 1. Obtención de segmentos basales caulinares en cultivares de
durante siete días. Las secciones nodales obtenidas fue- Rubus sp. a) Embrión de Rubus sp. b) Crecimiento y desarrollo delembrión en medio de establecimiento. c y d) Plántulas de Rubus sp.
ron colocadas en medios de cultivo de enraizamiento, a después de 90 días de cultivo in vitro. e) Preparación de secciones basales
base de las sales y vitaminas MS, myo-inositol 100mg/L, caulinares de Rubus sp. f) y g) Segmentos basales caulinares preparadospara la regeneración de brotes adventicios etiolados.
sacarosa 3%, ácido ascórbico 150 mg/L, buffer fosfato
18 mL/L, phytagel Sigma 0,15%, carbón activado 0,3%,
y suplementado con 1 mg/L de ácido indolbutírico (AIB) La respuesta morfogénica de los segmentos basales
y 1 mg/L de ácido naftalenacético (ANA) más 2 mg/L de caulinares sometidos a oscuridad entre los cultivares de
AIB. Rubus se muestra en la Tabla 1. En el primer tratamiento
El segundo tratamiento de etiolación, consistió en de oscuridad durante once días no se registraron
colocar nuevamente las secciones basales caulinares (con diferencias significativas en la respuesta morfogénica
brotes aéreos escindidos) de la primera cosecha de brotes en los tres cultivares, obteniendo valores de longitud
etiolados en medios de crecimiento y desarrollo y some- de brote que osciló entre 28,9 a 34,3 mm, número de
tido a etiolación por seis días (2° etiolación), siete días brotes 1,8 a 2,1 y número de yemas por brote 1,2 a 1,4.
de fotoperiodo, y en el día 13 de cultivo las secciones Igualmente, los segmentos basales caulinares sometidos
nodales fueron colocados en medio de enraizamiento. a un segundo tratamiento de oscuridad durante seis días
Por último, se utilizó un control en cada cultivar que no no mostraron diferencias significativas en las variables
fue expuesto a periodos de etiolación. evaluadas, registrándose longitud de brote entre 17,6 a
El análisis de datos de la respuesta morfogénica en 26,5 mm, número de brotes 1,8 a 2,1 y número de yemas
los segmentos basales caulinares de los cultivares de por brote 1,1 a 1,7.
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Regeneración y enraizamiento de brotes adventicios etiolados de cultivares de zarzamora (Rubus sp.)
Tabla 1. Respuestas morfogénicas de los segmentos basales caulinares Tabla 2. Respuestas morfogénicas de los segmentos basales caulinares
entre cultivares de Rubus sp. Castilla, Tupy y Navaho sometidos a entre cultivares de Rubus sp. Castilla, Tupy y Navaho sometidos a
tratamiento de oscuridad por periodos de 11 días (primera etiolación) y 6 tratamiento de oscuridad por periodos de 11 días (primera etiolación) y 6
días (segunda etiolación).. días (segunda etiolación).
Respuestas morfogénicas Cultivar versus Long. de Núm. de Núm. de
periodo brote (mm)1 brotes1 yema/brote1
Cultivar Tratam. Long. de Núm. de Núm. de
tratamiento
oscu- brote (mm)1 brotes yema/brote1
de oscuridad
ridad
(días) Castilla 11 días 28,9 ± 11,2 a 1,8 ± 0,6 a 1,4 ± 0,5 a
Castilla 06 días 17,6 ± 6,1 a 1,8 ± 0,7 a 1,5 ± 0,7 a
Castilla 11 28,9 ± 11,2 a 1,8 ± 0,6 a 1,4 ± 0,5 a
Tupy 11 30,8 ± 9,8 a 2,0 ± 0,4 a 1,2 ± 0,4 a Tupy 11 días 30,8 ± 9,8 a 2,0 ± 0,4 a 1,2 ± 0,4 a
Navaho 11 34,3 ± 8,9 a 2,1 ± 0,6 a 1,4 ± 0,7 a Tupy 06 días 26,5 ± 9,1 a 2,1 ± 0,3 a 1,1 ± 0,3 a
Navaho 11 días 34,3 ± 8,9 a 2,1 ± 0,6 a 1,4 ± 0,7 a
Castilla 6 17,6 ± 6,1 a 1,8 ± 0,7 a 1,5 ± 0,7 a
Navaho 06 días 22,0 ± 6,0 a 2,1 ± 0,6 a 1,7 ± 0,8 a
Tupy 6 26,5 ± 9,1 a 2,1 ± 0,3 a 1,1 ± 0,3 a
Navaho 6 22,0 ± 6,0 a 2,1 ± 0,6 a 1,7 ± 0,8 a 1 Medias con diferentes letras minúsculas indican diferen-
1 Medias con diferentes letras minúsculas indican diferencias sig- cias significativas entre cada una de los cultivares de Rubus
nificativas entre cada una de los cultivares de Rubus sp. en la sp. en la primera y segunda etiolación para ρ≤ 0,05 de
primera y segunda etiolación para ρ≤ 0,05 de acuerdo con la acuerdo con la prueba t.
prueba Tukey.
Por otro lado, los segmentos nodales en medio de
crecimiento y desarrollo sin tratamiento de oscuridad
registraron longitud de brotes, a los 21 días de cultivo,
en los cultivares Castilla 12,6 ± 2,9 mm, Tupy 12,7 ± 2,1
mm y Navaho 10,6 ± 3,6 mm, siendo estas longitudes
menores respecto a los brotes adventicios etiolados,
siendo la prueba significativa (Figura 2). Además,
estas plántulas mostraron una apariencia arrosetada que
no permitió la adecuada multiplicación a partir de
segmentos nodales, respuesta mejorada con los brotes
adventicios etiolados, los que mostraron alargamiento de
entrenudos, facilitando la propagación in vitro de esta Figura 3. Regeneración de brotes adventicios etiolados. a) Segmentos
especie (Figura 3a, 3b, 3c y 3d). basales caulinares de Rubus sp. b) Regeneración de brotes adventicios
etiolados. c) Brotes adventicios etiolados después de 7 días de exposición
a fotoperiodo 16/8h. d y e) Brotes nodales en medio de enraizamiento y f)
Segmentos nodales con raíces adventicias después de cuatro semanas.
Tabla 3. Respuestas morfogénicas en la inducción de raíces adventicias in
vitro de secciones nodales de Rubus sp. cultivares Castilla, Tupy y Navaho
a las cuatro semanas de cultivo in vitro.
Regul. crecimiento Respuesta morfogénica
Cultivares ANA AIB Long. Núm. de Sobreviv.
de (mg/L) (mg/L) de raíces raíces1 explante
Rubus (mm)1 (%)
sp.
Castilla 1 2 102 ± 46 a 2,5 ± 0,9 a 87,5
Figura 2. Efecto de los regímenes de luz y oscuridad versus el tratamiento Castilla — 1 97 ± 39 a 2,4 ± 1,8 a 96,7
sin oscuridad (control) sobre la longitud de brotes de los segmentos Tupy 1 2 81 ± 68 a 2,7 ± 0,8 a 100
basales caulinares en cultivares de Rubus sp. Castilla, Tupy y Navaho.
Medias en cada columna con diferentes letras minúsculas indican Tupy — 1 58 ± 51 b 2,7 ± 1,0 a 83,3
diferencias significativas entre cada uno de los cultivares de Rubus sp.
para ρ≤ 0,05 de acuerdo con la prueba t. Navaho 1 2 65 ± 54 1,7 ± 0,9 80,6
Navaho — 1 — — —
1 Diferentes letras indican diferencias significativas entre los trata-
Las respuestas morfogénicas dentro de los cultivares mientos para ρ≤ 0,05 de acuerdo a la prueba t.
de Rubus se muestra en la Tabla 1, cuyas medias en
dos periodos de oscuridad (11 y 6 días), no registraron
diferencias significativas en las variables evaluadas.
En la Tabla 3 se muestra la respuesta del
enraizamiento en los cultivares de Rubus sp a las cuatro
semanas de cultivoempleando las auxinas ANA y AIB
(Figura 3e y 3f). La longitud de raíces (102 y 97 mm)
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Millones Chanamé y Vásquez Castro
y número de raíces (2,5 y 2,4) en el cultivar Castilla marícense se obtienen en 60 días (Serafim et al., 2018).
no mostraron diferencias significativas. El cultivar Tupy Taiz y Zeiger (2013) indican que las plántulas desa-
registró diferencias significativas en la longitud de raíces rrolladas en oscuridad exhiben un crecimiento etiolado,
(81 mm), mostrando respuesta cuando se empleó ambas caracterizado por el alargamiento de los hipocótilos y
auxinas, en tanto, el número de raíces (2,7) no mostraron represión de genes regulados por la luz (aspectos esco-
diferencias significativas. El cultivar Navaho, registró tomorfogénicos), similares eventos pudieron observarse
respuesta de inducción de raíces cuando se empleó ambas en los brotes etiolados de los cultivares de Rubus sp.,
auxinas, registrando 65 mm y 1,7 de longitud y número donde los entrenudos experimentaron alargamiento y no
de raíces, respectivamente. acumularon clorofila en la oscuridad (Figura 3b). Por otro
lado, Taiz y Zeiger (2013), relatan que los pro-plastidios
de las plantas etioladas no sintetizan clorofila, y una
Discusión serie de enzimas y proteínas estructurales necesarias de
En su estado natural el género Rubus forma brotes la maquinaria fotosintética; estos pro-plastidios pueden
caulinares subterráneos, iniciando la activación de una o también desarrollar a cloroplastos, cuando las plántulas
más yemas latentes (Monasterio Huelin, 1995). Similar etioladas son iluminadas, evento similar a lo observado
proceso ha sido observado in vitro en el presente estudio, cuando los brotes etiolados de Rubus sp. fueron someti-
donde los segmentos basales caulinares sometidos a os- dos a exposición de luz por siete días (Figura 3c).
curidad, probablemente permitió la activación de yemas En la presente investigación, el medio de enraiza-
latentes, reflejado en la regeneración de brotes adventi- miento permitió inducir raíces en los segmentos nodales
cios, lo cual probablemente pueda ser explicado que el a la cuarta semana de cultivo in vitro, y estuvieron aptos
tratamiento en oscuridad tiene un efecto positivo en la para su posterior fase de aclimatación. En tanto, Millones
producción de auxinas que permite la inducción y alarga- (2018), empleando 1 mg/L de AIB en la accesión silves-
miento del brote etiolado (Yang et al., 2019; Wang et al., tre de Rubus sp. (004-Rsp-UNTRM) registraron induc-
2019). Por otra parte, Muktadir et al. (2016) evaluaron la ción de raíces a la novena semana de cultivo, similares
eficiencia de la regeneración de hipocótilos de plántulas respuestas de inducción de raíces fueron registrados en
de Solanum melongena, donde los periodos de oscuridad Rubus idaeus, R. futicosus empleando 1 mg/L de AIB,
mejoran la regeneración de brotes adventicios, Zhang et cuyas raíces fueron observadas después de seis semanas
al. (2016) reportaron que los hipocótilos y meristemos de incubación (Hunková et al., 2016). Asimismo, Lebe-
apicales de Ricinus communis requirieron tratamiento de dev et al. (2019) registraron inducción de raíces a la sexta
oscuridad para promover un mayor número de brotes semana de cultivo en R. idaeus cuando emplearon 0,2 y
adventicios, Wang et al. (2019), empleando thidiazuron y 0,1 mg/L de AIB.
14 días de cultivo bajo oscuridad en explantes foliares de
Fragaria vesca obtuvieron alto porcentaje y regeneración
de brotes por explante. Makenzi et al. (2018), colocando Conclusiones
esquejes de Ipomoea batata en oscuridad, demostraron Los segmentos basales caulinares de Rubus sp. cultivares
que el número de yemas adventicias fueron mayores en Castilla, Tupy y Navaho, sometidos a periodos de 11 o 6
aquellas colocadas bajo luz. Igualmente, Zhao et al. días en oscuridad, regeneran brotes adventicios etiolados
(2013) al someter explantes de Rhodiola crenulata a un sin el empleo de reguladores de crecimiento, facilitando
pretratamiento de oscuridad, obtuvieron mayor números la propagación in vitro de estos cultivares.
de brotes comparado a un control sin tratamiento de La combinación de AIB 2 mg/L más ANA 1 mg/L
oscuridad. en el medio de enraizamiento, fueron adecuados en la
En tanto, en Lachenalia sp. la regeneración del nú- inducción de raíces adventicias en segmentos nodales de
mero de brotes y yemas empleando oscuridad está por los cultivares de Rubus sp.
debajo de las condiciones del espectro de luz blanca/azul La regeneración de brotes adventicios etiolados en
y por encima del espectro de luz roja (Bach et al., 2018). los tres cultivares de Rubus sp. se obtiene en seis
Por otra parte, en yemas de Capsicum el tratamiento de semanas aproximadamente, es decir una semana en el
oscuridad por siete días no tiene efecto en la organogéne- proceso de etiolación, una semana bajo fotoperiodo de
sis (Gammoudi et al., 2018). los brotes etiolados y cuatro semanas de inducción de
El género Rubus ha sido propagado exitosamente raíces adventicias bajo iluminación.
por cultivo de tejidos, es así que, Cancino-Escalante et
al. (2015) en el cv. Castilla registraron 21,6 mm de
longitud de brotes y 1,8 brotes por explante empleando Referencias
reguladores de crecimiento 2,5 mg/L de BAP más 0,03 Alice, L. A. y Campbell, C. S. (1999). Phylogeny of Rubus
mg/L de AG3 a las cuatro semanas de establecidos in (Rosaceae) based on nuclear ribosomal DNA internal
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de inmersión temporal. En el presente estudio se registró
similares respuestas morfogénicas en el cv. Castilla y Ayub, R. A., Dos Santos, J. N., Zanlorensi, L. A., Da Silva,
Tupy sin el uso de reguladores de crecimiento y en menor D. M., De Carvalho, T. C. y Grimaldi, F. (2019). Sucroseconcentration and volume of liquid medium on the in
tiempo. Sin embargo, existen reportes de regeneración vitro growth and development of blackberry cv. Tupy in
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mayor periodo de tiempo, como los reportados en brotes 43. https://doi.org/10.1590/1413-7054201943007219.
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Cauduro et al., 2016); y brotes etiolados de Anthurium
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Regeneración y enraizamiento de brotes adventicios etiolados de cultivares de zarzamora (Rubus sp.)
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