UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA FACULTAD DE CIENCIAS “CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LAS LLAMAS (Lama glama) CH'AKU y CCARA DEL BANCO DE GERMOPLASMA DE ALPACAS DE COLOR Y LLAMAS DEL CENTRO EXPERIMENTAL ILLPA-INIA ANEXO QUIMSACHATA, USANDO MARCADORES MICROSATÉLITES” Presentado por: GABRIELA FABIOLA PAREDES ROJAS TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE: BIÓLOGO Lima - Perú 2013 1 2 3 DEDICATORIA A MIS PADRES Y ABUELOS, COMO A MIS HERMANOS BRANDO Y SANDRA, A LA MEMORIA DE MI PRIMO DANIEL Y MI AMIGO DIÓGENES 4 AGRADECIMIENTO  A mi familia por su apoyo incondicional durante el periodo de la tesis. Los amo mucho.  A la Universidad Nacional Agraria La Molina, especialmente a la Facultad de CIENCIAS por haberme instruido y acogido durante mi tiempo de estudiante.  Al Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA) por brindarme la oportunidad de realizar el trabajo de investigación en el laboratorio de Biología Molecular y Genómica.  Al Doctor Gustavo Gutiérrez, asesor de este trabajo, por su valioso apoyo y por todas las oportunidades académicas brindadas.  Al Ingeniero Eudosio Veli por su apoyo constante, y por el gran aporte de conocimiento en el tema desarrollado.  A la Bióloga Adriana Vallejo por compartir su vasta experiencia y conocimiento siempre con sencillez y mucha alegría.  A la Bióloga Claudia Yalta por sus indicaciones, apuntes constantes y compartir su experiencia con paciencia y amistad.  A todos mis amigos del laboratorio por hacer de él un lugar muy valioso de trabajo.  A mis profesores de la UNALM, en especial a la profesora Patricia Moreno, porque ella me inculcó las ganas de ser Bióloga. 5 ÍNDICE GENERAL Página I. INTRODUCCIÓN 16 II. REVISION DE LITERATURA 2.1 Los camélidos sudamericanos en la historia y actualidad del Perú 18 2.2 Las llamas 19 2.2.1 Tipos de llamas 20 2.3 Banco de Germoplasma de Alpacas y Llamas del Centro Experimental ILLPA-INIA, anexo Quimsachata 21 2.3.1. Antecedentes 21 2.3.2 Características del Banco de Germoplasma de Alpacas de color y Llamas 21 2.3.3 Importancia de la población de llamas del Banco de Germoplasma de Alpacas de color y Llamas 22 2.4 Análisis de la diversidad genética mediante marcadores moleculares 23 2.4.1 Marcadores microsatélites 24 2.4.2 Cebador universal M13 25 2.4.3 Estudios moleculares en llamas 28 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Fase de campo 30 3.2 Fase de laboratorio 32 3.2.1 Extracción de ADN genómico a partir de sangre 32 3.2.2 Calidad y cuantificación del ADN extraído 34 3.2.3 Amplificación de ADN microsatélite 35 3.2.4 Uso del analizador genético para electroforésis capilar 41 3.2.5 Análisis de datos 43 3.3 Fase de análisis de parámetros genéticos poblacionales 44 6 3.3.1 Análisis de diversidad alélica 44 a. Frecuencias alélicas 44 b. Heterocigosidad esperada 44 c. Heterocigosidad observada 45 d. Contenido de información polimórfica 45 3.3.2 Equilibrio Hardy-Weinberg 45 3.3.3 Alelos nulos 46 3.3.4 Diversidad genética de NEI 47 3.3.5 Análisis de la estructura genética de las poblaciones 48 a. Estadísticos F de Wright 48 b. Análisis de Varianza Molecular 49 c. Análisis de la Estructura de la Población 49 3.3.6 Flujo génico 50 3.3.7 Análisis factorial de correspondencia 50 IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES 4.1 Fase de análisis de parámetros genéticos poblacionales 51 4.1.1 Frecuencias alélicas 53 4.1.2 Heterocigosidad esperada y observada 62 4.1.3 Contenido de información polimórfica 64 4.1.4 Equilibrio Hardy-Weinberg 65 4.1.5 Alelos nulos 69 4.1.6 Diversidad genética 70 4.2 Diferenciación genética entre las llamas Ch’aku y Ccara 71 4.2.1 Estadísticos F de Wright 72 4.2.2 Análisis de varianza molecular 76 4.2.3 Análisis de la estructura de la población 77 4.3 Flujo génico 78 4.4 Análisis factorial de correspondencia 79 7 V. CONCLUSIONES 80 VI. RECOMENDACIONES 81 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 82 VIII. ANEXOS 91 8 ÍNDICE DE CUADROS Página Cuadro 1. Ficha de Campo 31 Cuadro 2. Los cebadores y la secuencia M13, usados para amplificar regiones 36 microsatélite en la población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata Cuadro 3. Combinaciones para reacciones en multiplex y simplex en PCR, 37 rango (pb), marcaje y temperatura óptima de los microsatélites Cuadro 4. Condiciones de Mezcla de amplificación del Grupo I (M1, S1 y M2) 38 Cuadro 5. Condiciones de Mezcla de amplificación del Grupo II (M3, M4 y S2) 39 Cuadro 6. Grupos asignados para el Analizador Genético según su fluorescencia y 42 volumen usado en el Analizador de cada reacción Multiplex (M) y/o simplex (S) Cuadro 7. Número de alelos por locus en cada población de llamas del Banco de 52 Germoplasma de Quimsachata Cuadro 8. Valores de He y Ho en cada población y en la población total de llamas del 63 Banco de Germoplasma de Quimsachata Cuadro 9. Contenido de Información Polimórfica de las poblaciones de llamas 64 Ch’aku y Ccara Cuadro 10. Análisis de la desviación del Equilibrio Hardy-Weinberg global por marcador 66 9 Cuadro 11. Análisis de la desviación del equilibrio HW por marcador y por 68 población, por medio de la FIS de Weir y Cockerhan y Robertson y Hill (1984). Score Test 5000 iteraciones Cuadro 12. Frecuencia de alelos nulos por locus 69 Cuadro 13. Diferenciación genética entre las poblaciones de llamas del Banco 72 de Germoplasma de Quimsachata Cuadro 14. Estadísticos F para todos los loci de la población total de llamas del Banco 73 de Germoplasma de Quimsachata Cuadro 15. Estadísticos F global de la población total de llamas del Banco de 75 Germoplasma de Quimsachata Cuadro 16. Valores de FIS promedio para ambas poblaciones 76 Cuadro 17. Resultados del análisis de varianza molecular (AMOVA) de las dos 77 poblaciones del Banco de Germoplasma de Quimsachata 10 ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Fenotipos de llamas a) Ccara y b) Ch'aku 20 Figura 2. Vista de la sede de la Estación Experimental ILLPA-anexo Quimsachata 22 Figura 3. Población de llamas del Banco de Germoplasma de Alpacas de color y 23 Llamas del anexo Quimsachata-INIA Figura 4. Procedimiento de amplificación y marcaje del cebador universal M13 27 (modificado de Arruda et al., 2010) Figura 5. Mapa DIVA-GIS del Banco de Germoplasma de Alpacas de Color y 30 Llamas de Quimsachata Figura 6. a). Equipo Epoch para cuantificar ADN; b). Cargado de muestras 34 para cuantificación. Figura 7. a). Preparación de muestras para electroforésis capilar; b). Cargado de placa 41 de en el Analizador Genético ABI 3130XL Figura 8. Electroferograma de los marcadores amplificados 43 Figura 9. Frecuencias alélicas del marcador GLM4 en las poblaciones de llamas 53 Ch’aku y Ccara Figura 10. Frecuencias alélicas del marcador LAB1 en las poblaciones de llamas 54 Ch’aku y Ccara Figura 11. Frecuencias alélicas del marcador LCA54 en las poblaciones de llamas 54 Ch’aku y Ccara Figura 12. Frecuencias alélicas del marcador LCA65 en las poblaciones de llamas 55 Ch’aku y Ccara Figura 13. Frecuencias alélicas del marcador LCA77 en las poblaciones de llamas 56 Ch’aku y Ccara Figura 14. Frecuencias alélicas del marcador LCA82 en las poblaciones de llamas 56 Ch’aku y Ccara 11 Figura 15. Frecuencias alélicas del marcador LCA83 en las poblaciones de llamas 57 Ch’aku y Ccara Figura 16. Frecuencias alélicas del marcador LCA85 en las poblaciones de llamas 58 Ch’aku y Ccara Figura 17. Frecuencias alélicas del marcador LGU76 en las poblaciones de llamas 58 Ch’aku y Ccara Figura 18. Frecuencias alélicas del marcador YWLL08 en las poblaciones de llamas 59 Ch’aku y Ccara Figura 19. Frecuencias alélicas del marcador YWLL44 en las poblaciones de llamas 60 Ch’aku y Ccara Figura 20. Frecuencias alélicas del marcador YWLL59 en las poblaciones de llamas 61 Ch’aku y Ccara Figura 21. Frecuencias alélicas del marcador VOLP03 en las poblaciones de llamas 61 Ch’aku y Ccara Figura 22. Diversidad genética por locus y por población 71 Figura 23. Análisis de la estructura de las dos poblaciones de llamas del 78 Banco de Germoplasma de Quimsachata. Figura 24. Representación tridimensional del Análisis Factorial de Correspondencia 79 entre las dos poblaciones de llamas (Amarillo: Ch’aku y Azul: Ccara) 2 ÍNDICE DE ANEXOS Página ANEXO I. Datos de colecta de cada llama seleccionada del Banco de 91 Germoplasma de Quimsachata ANEXO II. Concentración y Calidad del ADN Stock 98 ANEXO III. Concentración y Calidad de Dilución del ADN. 114 13 RESUMEN En 1987, el Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA) estableció en la Estación Experimental ILLPA (Puno), anexo Quimsachata “el Banco de Germoplasma de Alpacas y Llamas de color” orientado a la conservación de la diversidad genética de los camélidos domésticos de los departamentos de Puno y Cuzco. Sin embargo, hasta la fecha no se habían desarrollado trabajos de caracterización genética de la población de llamas, datos básicos para garantizar la conservación de este recurso natural del Perú. El presente trabajo analizó la diversidad y el grado de diferenciación genética de 251 llamas (92 y 159 fenotipos Ch'aku y Ccara, respectivamente) del Banco de Germoplasma de Quimsachata, mediante la aplicación y análisis de 13 marcadores microsatélites específicos de camélidos sudamericanos, reportados internacionalmente, usando la metodología de marcaje fluorescente por medio del cebador universal M13. Los resultados reportaron altos niveles de polimorfismo en los marcadores, determinando alta diversidad genética. Se identificaron 157 alelos diferente, un promedio de 12.08 alelos por marcador, heterocigosidad esperada promedio por marcador: 0.758 y PIC promedio por marcador: 0.723. La prueba del equilibrio Hardy-Weinberg demostró que, en general, los loci estuvieron en desequilibrio debido a un déficit de heterocigotos (FIS promedio: 0.063) y no se debió a alelos nulos. A pesar que las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara del Banco son manejadas por separado, la diferenciación genética entre ellas es muy baja (FST =0.01), esto indica una débil estructura genética, y existe un intenso flujo genético entre ambas poblaciones. Probablemente su mismo proceso de domesticación y el intercambio frecuente de reproductores en los rebaños de donde provienen, ha envuelto cruzamientos entre ambos fenotipos. El presente trabajo puede contribuir a un mejor manejo del Banco en cuestión y el set de marcadores microsatélites utilizados son robustos para llevar a cabo estudios de diversidad genética en la población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata el cual presenta elevada diversidad genética. Palabras clave: Lama glama, Banco de Germoplasma, diversidad genética, marcadores microsatélites. 14 ABSTRACT In 1987, the National Institute for Agrarian Innovation (INIA) established at the ILLPA- Experimental Station in Quimsachata (Puno) Peru “the Germplasm Bank of colored Alpacas and Llamas” created to conserve the genetic diversity of domestic camelids from the regions of Puno and Cuzco. Nevertheless, to this date there have not been developed genetic characterization studies of the llama population, essential data to guarantee the conservation of this natural resource from Peru. Thirteen microsatellite loci, reported internationally and specific of South American camelids, were used to assess the genetic variability and genetic differentiation parameters of 251 llamas from the Germplasm Bank of Quimsachata (92 and 159 belonging to Ch’aku and Ccara phenotypes, respectively). The results reported high levels of polymorphism (a total of 157 different and average: number of alleles, expected heterozigosity, PIC across per marker: 12.08, 0.758 and 0.723, respectively). The Hardy-Weinberg equilibrium test showed that, in general, the loci microsatellite were in disequilibrium due to heterozygote deficits (average FIS: 0.063) and not because of the presence of null alleles. Although the two llama populations, Ch’aku and Ccara, are manage separately. The genetic differentiation between them is very low (FST=0.01), this indicates a week genetic structure, and there is an intense gene flow between both populations. Probably, its domestication process and the frequent exchange of reproductive males in the herds where they come from, has involved breeding between both phenotypes. The present study may contribute to improve the management of the Bank and the set of microsatellite markers utilized are informative to carry on studies of genetic diversity in the llama population of the Germplasm Bank of Quimsachata, which has high genetic diversity. Key words: Lama glama, Germplasm bank, genetic diversity, microsatellite markers. 15 I. INTRODUCCIÓN El Perú es el centro más importante de camélidos sudamericanos (CSA) y su crianza constituye una de las actividades de mayor impacto socio económico para los pobladores alto andinos de nuestro país (Revista Agroinnova, 2011). La llama, Lama glama, es el camélido sudamericano doméstico más grande y mejor adaptado a un amplio rango de condiciones medioambientales (Bustamante et al., 2006) y presenta dos variedades o fenotipos: Ccara o Pelada y Ch’aku o Lanuda. La industria textil nacional e internacional ha mostrado una especial predilección por las fibras de color blanca a razón de su versatilidad al teñido. Esta situación originó que muchos rebaños de alpacas del país inicien un intenso proceso de blanqueo, disminuyendo las poblaciones de alpacas de color, al igual que se incrementó la saca de llamas para reemplazarlas por alpacas blancas (Enríquez, 2003). Ante el blanqueo inminente de los rebaños de camélidos domésticos del Perú y por ende la pérdida de su diversidad genética, y teniendo en cuenta que en el departamento de Puno se encuentra la mayor población de CSA domésticos del Perú; en 1987, con el apoyo técnico, financiero del Proyecto Alpacas (PAL), Convenio de Cooperación Técnica del Gobierno Suizo COTESU-INIA, se estableció en el Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA), en la Estación Experimental IIlpa, anexo Quimsachata, un Banco de Germoplasma de Alpacas y Llamas orientado a la recuperación y conservación de alpacas de color, y llamas en sus dos fenotipos Ch'aku y Ccara (Huanca, 2007). 16 La conservación de razas y/o poblaciones ha tomado un gran auge ya que se desea evitar la pérdida de los reservorios únicos de recursos genéticos valiosos que pueden ser usados para lograr un desarrollo sostenible. En el caso de las poblaciones de llamas, Lama glama, Ch'aku y Ccara ubicadas en el Banco de Germoplasma de Quimsachata, su biodiversidad simboliza patrimonio natural, económico, cultural e histórico del departamento de Puno y Cuzco, y debe presentar una elevada diversidad genética para ser considerada un adecuado stock genético que pueda contribuir a garantizar la conservación de este recurso y a aumentar la viabilidad y productividad de las poblaciones de llamas en ambos departamentos. Además, la caracterización genética del Banco puede contribuir a implementar futuras estrategias para un manejo efectivo y evaluar posibles pérdidas en la diversidad genética. Los marcadores de ADN microsatélite (SSR) se han convertido en la principal fuente de marcadores genéticos, ya que son abundantes, están distribuidos regularmente en el genoma, se heredan de forma codominante y poseen un elevado grado de variabilidad en las poblaciones. Debido a ello, son herramientas de uso corriente para evaluar la diversidad y estructura genética de las poblaciones (Weber y May, 1989). Por lo tanto, el presente trabajo tuvo como objetivos analizar la diversidad genética y determinar el grado de diferenciación genética entre los dos fenotipos de llamas, Ch'aku y Ccara del Banco de Germoplasma de Alpacas y Llamas de Color del INIA mediante la aplicación y análisis de 13 loci microsatélites reportados internacionalmente en CSA usando el cebador universal M13. 17 II. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1 LOS CAMÉLIDOS SUDAMERICANOS EN LA HISTORIA Y ACTUALIDAD DEL PERÚ Los Camélidos Sudamericanos (CSA) representan un elemento natural que está relacionado de un modo muy íntimo con la sociedad, historia y economía del Perú; derivan de especies prehistóricas originadas en Norteamérica que desaparecieron de esa región hace más de 11 millones de años. Antes de su desaparición algunos camélidos ancestrales migraron hacia el sur del continente para evolucionar en los CSA actuales que incluyen dos especies domésticas: llama (Lama glama) y alpaca (Vicugna pacos) y dos especies silvestres: guanaco (Lama guanicoe) y vicuña (Vicugna vicugna). Estudios de ADN mitocondrial sugieren que la vicuña y el guanaco fueron los antecesores de las alpacas y las llamas, respectivamente, en un proceso de domesticación que comenzó en los Andes Centrales de Sudamérica hace 6000 años (Kadwell et al., 2001; Marin et al., 2007). Desde tiempos ancestrales los camélidos domesticados, llamas y alpacas, fueron de gran importancia en los Andes, representando estatus, riqueza y proveyendo un amplio rango de bienes y servicios, incluyendo sacrificios religiosos, transporte y medicina (Shimada et al., 1985). El uso textil de sus fibras se inició con la Cultura Huaca Prieta hace 2500 años (Wheeler et al., 2004), tuvo un desarrollo evidente en la Cultura Paracas y posteriormente alcanzó niveles de excelencia en la Cultura Mochica (Wing, 1977). Después de la conquista, se redujo su número y distribución geográfica y también su significancia económica ya que muchos de sus roles fueron usurpados por animales provenientes de Europa (ovejas, cerdos y burros). 18 La crianza de alpacas y llamas es una actividad económica relevante para las regiones andinas, destacando la producción de fibra fundamentalmente la de alpaca que posee una alta valoración en los mercados internacionales por su fina textura. La carne en forma contraria, tanto de llama como de alpaca, posee un consumo muy bajo en los medios urbanos, pese a sus extraordinarias cualidades nutritivas, como lo son el bajo porcentaje de grasa y un nivel de proteína más alto en relación a otras especies, características adecuadas para los perfiles nutricionales de las sociedades modernas (FAO, 2005). 2.2 LAS LLAMAS La llama, Lama glama, es el CSA doméstico más grande y mejor adaptado a un amplio rango de condiciones medioambientales (Bustamante et al., 2006). Se asemeja en muchos aspectos morfológicos y comportamentales a su progenitor silvestre, el guanaco (Wheeler, 1995) y su hábitat se circunscribe al medio ecológico alto andino, entre los 2300 a 4000 m s n m., donde existen pastos escasos y fibrosos de bajo valor nutricional. Se le clasifica en el orden Artiodactyla, suborden Tylopoda, familia Camelidae y tribu Lamini (Wheeler et al., 2004). Las fibras crecen entre 10 y 20 centímetros por año y no es tan fina como la de las alpacas ya que tienen un grosor de 26 y 28 micrones en promedio. Son seleccionadas por el peso de su vellón, más que por la uniformidad de su color o la finura de su fibra. Por lo tanto, a diferencia de las alpacas, la presión de selección para colores blancos ha sido menor para ellas y los colores de sus prendas van desde un rango de blanco al negro, con sombras de beige, marrón y rojo (Vila, 2004). En el Perú, especialmente en el departamento de Puno, el cuál alberga la mayor población de llamas; estas son uno de los animales más útiles e importantes para la economía local, debido principalmente a que: se consume su carne, son animales de carga, su fibra se usa para tejer abrigos y ocasionalmente sus intestinos son usados para hacer cuerdas y tambores y su excremento es usado como combustible (Wilson y Reeder, 2005). En cuanto a su crianza, las llamas se manejan y producen en sistemas de producción pequeños y por productores de escasos recursos económicos. Los sistemas explotan la pradera nativa 19 comunitariamente aunque con cargas animales que sobrepasan su capacidad productiva, y en aquellos sistemas donde la producción de llama es un componente central, el pastoreo sigue una rotación estacional, más notoria en zonas de producción extensiva. En algunos sistemas los machos se incluyen en rebaños separados de las hembras para ser pastoreados por la comunidad en lugares alejados, y luego reunidos durante la época de monta que coincide con las lluvias de enero y marzo (Quispe et al., 2009). 2.2.1 TIPOS DE LLAMAS Se reconocen dos fenotipos de llamas: Ccara o Pelada y Ch’aku o Lanuda (Figura 1). Los tipos Ccara, son reconocidos por sus cuerpos delgados y largos y su pelaje corto, son más pesadas que las lanudas y poseen mayor aptitud para la producción de carne pero menor rendimiento en vellón y menor calidad de fibra (Iñiguez et al., 1998). Por el contrario, las llamas Ch’aku son compactas con cuerpos más cortos y tienen mayor potencial para la producción de fibras, las cuales son más finas que las Ccara (Maquera, 1991). Estos fenotipos tienen carácter hereditario y se identifican en el rebaño como fenotipos extremos; sin embargo, existen los intermedios de difícil categorización (Iñiguez et al., 1998). a b Figura 1. Fenotipos de llamas a) Ccara y b) Ch'aku. 20 2.3 BANCO DE GERMOPLASMA DE ALPACAS Y LLAMAS DEL CENTRO EXPERIMENTAL ILLPA- INIA, ANEXO QUIMSACHATA 2.3.1 ANTECEDENTES La industria textil nacional e internacional ha mostrado una especial predilección por las fibras de color blanca a razón de su versatilidad al teñido. Esta situación originó que muchos rebaños de alpacas del país inicien un intenso proceso de blanqueo, donde la proporción de alpacas de color disminuyó considerablemente, al igual que se incrementó la saca de llamas para reemplazarlas por alpacas blancas. Este hecho en la opinión de los criadores de camélidos, se resume en la siguiente expresión: “las alpacas de color sólo existen como lunares dentro de nuestros rebaños de alpacas blancas” (Enríquez, 2003). Ante el blanqueo inminente de los rebaños de camélidos domésticos del Perú y por ende la pérdida de su diversidad genética, en 1987, con el apoyo técnico y financiero del Proyecto Alpacas (PAL), Convenio de Cooperación Técnica del Gobierno Suizo COTESU INIA, se estableció en la Estación Experimental IIlpa Puno, anexo Quimsachata, un Banco de Germoplasma de Alpacas y Llamas orientado inicialmente a la recuperación y conservación de alpacas de color y llamas en sus dos ecotipos Ch'aku y Ccara (Huanca, 2007). 2.3.2 CARACTERÍSTICAS DEL BANCO DE GERMOPLASMA DE ALPACAS DE COLOR Y LLAMAS El Banco de Germoplasma de alpacas de color y llamas es propiedad del INIA y se ubica en la estación experimental ILLPA-anexo Quimsachata, sobre los 4,100 m s n m., entre los distritos de Cabanillas y Santa Lucía, y las provincias de San Román y Lampa, en la región Puno. Su principal objetivo es contribuir al incremento de los niveles de producción y productividad de la crianza de camélidos, generando alternativas tecnológicas para impulsar la crianza sostenible y la conservación de la diversidad genética de este recurso natural del Perú (Revista Agroinnova, 2011). 21 Pertenece a la zona agroecológica de Puna Seca ambiente árido, extremadamente frío con precipitación pluvial de 450 a 600 mm, disminuyendo a niveles de 353 mm en años secos. La temperatura fluctúa entre 3°C de Mayo a Julio y 15°C entre setiembre y diciembre; siendo el promedio de 7.8ºC. Su principal recurso agroecológico son las gramíneas y en menor grado las compuestas, ciperáceas, juncáceas y leguminosas. Figura 2. Vista de la sede de la Estación Experimental ILLPA-anexo Quimsachata. 2.3.3 IMPORTANCIA DE LA POBLACIÓN DE LLAMAS DEL BANCO DE GERMOPLASMA DE ALPACAS DE COLOR Y LLAMAS En los últimos años la conservación de razas y/o poblaciones de distintas especies ha cobrado gran auge porque se desea evitar la pérdida de la diversidad genética pues disminuye la capacidad de recuperar especies amenazadas y mantener y mejorar el rendimiento de otras incluidas en el circuito productivo (Aranguren-Méndez et al., 2001). En el caso de la población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata, su biodiversidad simboliza patrimonio natural, cultural, histórico y económico ya que representa una fuente importante para el sustento y la vida de los productores alto andinos. Por lo tanto el país tiene el deber de proteger este recurso genético valioso y único. 22 Figura 3. Población de llamas del Banco de Germoplasma de Alpacas de color y Llamas del anexo Quimsachata-INIA. 2.4 ANÁLISIS DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES El estudio de diversidad genética de las poblaciones se ha enfocado en los patrones de diversidad del genoma de los individuos haciendo uso de marcadores moleculares con el fin de evaluar el estado genético de las poblaciones y así proponer medidas para preservar la diversidad genética. Sin embargo, la aplicación de los marcadores moleculares en conservación no se limita a esto, sino que ésta también pueden contribuir de manera fundamental al entendimiento de la historia evolutiva, la demografía y la ecología de las especies y poblaciones (Godoy, 2009). Eventualmente estos datos pueden ser utilizados como referencia empírica en la elaboración de programas de conservación de especies catalogadas como vulnerables o en peligro de extinción (Moritz, 1999). Los marcadores moleculares son secuencias de ADN que permiten identificar o diferenciar genotipos, cuya transmisión de una generación a otra es posible de seguir. Estos pueden ser genes o segmentos de ADN cuyo producto no se conoce, pero que se transmiten de manera mendeliana y generan patrones polimórficos y monomórficos. Los polimórficos mayormente 23 identifican diferencias intra poblacionales y los monomórficos diferencian especies o géneros debido a que son zonas altamente conservadas. Se caracterizan por tener una locación cromosómica fija y poder presentar diferentes variantes o alelos que determina su elevado polimorfismo, además se deben identificar de una manera sencilla, rápida y económica. Se han convertido en la herramienta más utilizada para estudios filogenéticos, análisis de variabilidad genética en poblaciones, establecimiento de mapas genómicos, así como el diagnóstico de determinadas enfermedades hereditarias (Klug, 2005). Son numerosos los marcadores moleculares descritos como: los RFLPs (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms), RAPDs (Random Amplified Polimorphic DNA) o AFLPs (Amplified Fragment Lenght Polymorphisms), todos ellos caracterizados por no precisar conocimientos previos del genoma a analizar. En estudios poblacionales los marcadores más utilizados son los microsatélites, por sus características ventajosas,y de más reciente aparición los polimorfismos de un sólo nucleótido (Single Nucleotide Polymorphism o SNPs) (Cortés, 2008). 2.4.1 MARCADORES MICROSATÉLITES Los microsatélites, también conocidos como secuencias simples repetidas (SSR) por sus siglas en inglés, o pequeñas repeticiones en tándem (STR), son regiones de ADN no codificante compuestas de pequeños motivos de 1 a 6 nucleótidos repetidos en tándem los cuales están ampliamente distribuidos en el genoma de eucariotas y procariotas (Tóth et al., 2000). En base al tipo de microsatélite se pueden clasificar en tres familias: perfectos, compuesta por una simple repetición de “n” veces de la secuencia base; imperfectos, compuesta entera por una secuencia repetida intercalada entre las repeticiones; y compuestos, constituidos por dos o más tramos de motivos repetidos diferentes (Weber y May 1989). Entre las ventajas que presentan los microsatélites están: su abundancia y distribución en el genoma, alto nivel de polimorfismo y herencia codominante (Litt et al., 1989), son 24 comparativamente fáciles de automatizar, con la amplificación múltiple de hasta cinco sitios posibles en una sola reacción de PCR. Además el análisis de los microsatélites por medio de software es comparativamente fácil y posible. Todas estas ventajas indican la posibilidad de rastrear la demografía, movimientos, y la estructura social de poblaciones sin necesitar entrar en el contacto directo con los animales (Goldstein et al., 1999). La desventaja de su utilización está en la necesidad del conocimiento previo de la secuencia para poder analizar el polimorfismo (Frankham et al., 2002). Además de la inversión inicial de recursos económicos y la experiencia técnica requerida para el clonamiento y secuenciamiento de los loci SSR. Por otro lado, limitaciones con menor frecuencia, se darían en el caso que mutaciones, ocurridas en el sitio de apareamiento de los iniciadores, tendrían como resultado alelos nulos (Yañez, 2002). A partir de la demostración de la existencia de variabilidad genética en estas regiones y la posibilidad de su detección mediante amplificación por PCR (Weber y May, 1989), los microsatélites se han convertido en la principal fuente de marcadores genéticos y están adquiriendo una importancia creciente en los últimos años en estudios sobre análisis de variabilidad genética y relaciones entre especies y razas, controles de paternidad o identificación de muestras (Marklund et al., 1994), estudio de las poblaciones y la posibilidad que presentan de conocer la historia evolutiva de estas especies (Hoelzel, 1998). Los microsatélites, también se han utilizado para detectar situaciones de “cuello de botella” consanguinidad, migración, filogenia, hibridación entre poblaciones o, tamaño efectivo de las poblaciones, selección asistida por marcadores y la generación de mapas cromosómicos (Darío, 2008). 2.4.2 CEBADOR UNIVERSAL M13 Diversas metodologías son usadas para determinar los alelos generados por los microsatélites. Por ejemplo, los sistemas de láser automatizados usan fragmentos con marcación fluorescente obtenidos por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permiten 25 una visualización exitosa de los alelos (Bonin et al., 2004; Hoffman et al., 2005) y la rápida selección de secuencias polimórficas de múltiples loci genómicos. Sin embargo, el costo de producir un nuevo cebador marcado fluorescentemente para cada uno de los miles de loci potencialmente informativos, es un factor limitante para muchos laboratorios, ya que su costo presenta un incremento de entre cinco y diez veces más que los no marcados. Además, tales cebadores son frecuentemente necesarios para genotipar solo unas decenas o cientos de muestras, y son luego almacenados por cantidades variables de tiempo durante los cuales la fluorescencia puede decaer rápidamente (Missiaggia et al., 2006). Por lo tanto, con el fin de reducir este costo de genotipificación con microsatélites marcados fluorescentemente, Oetting et al., (1995) propusieron una estrategia de PCR llamada multiplex, la cual emplea un cebador forward con una extensión adicional de 18 pb en su extremo 5' idéntica a la secuencia del cebador M13 (TGTAAAACGACGGCCAGT), un cebador regular reverse y un tercer cebador universal M13 marcado con fluorescencia. El cebador universal M13 es una secuencia derivada de un vector bacterial (David et al., 1993) que no presenta homología con alguna secuencia conocida en la base de datos de los genomas de mamíferos, por lo que reduce la cantidad de amplificaciones inespecíficas que pueden resultar en interpretaciones erróneas de los resultados (Arruda et al., 2010). La descripción de la técnica se indica en la figura 4 (modificada de Arruda, 2010). El cebador unido a la ¨cola¨ M13 provee una secuencia complementaria del cebador universal fluorescente (M13 unido a un fluorescente) desde el tercer ciclo de PCR, generando un producto que puede ser detectado en un secuenciador automático de ADN, el cuál separa las bandas de microsatélites con paneles compuestos de cuatro colores, un color cada uno; donde cada panel permite realizar reacciones de amplificación en múltiplex, ya que en él es posible combinar 4 cebadores o más de un mismo colorante fluorescente optimizando las temperaturas de alineamiento en PCR y los tamaños de los productos de PCR (Neilan, 1997), todas estas combinaciones son evaluadas a través de un único capilar con una separación del tamaño estándar, permitiendo estimados del tamaño de la banda. 26 Por lo tanto la elección de esta técnica, en vez del marcaje directo de los colorantes con los cebadores, presenta gran cantidad de ventajas: primero los costo se reducen entre 540-720$ por locus si se usan 6 microsatélites (Schuelke, 2000), evitando la necesidad de usar diversas secuencias para el proceso de marcaje fluorescente. Además, por la considerable reducción en el tiempo, esta técnica es indicada cuando grandes cantidades de datos deben ser analizados en el mismo tiempo (Oblessuc et al., 2009). Sin embargo, aunque la mayoría de estos estudios usan la secuencia M13 como secuencia de cola, cualquier otra secuencia que no tenga una secuencia complementaria en el genoma objetivo bajo estudio podría potencialmente ser usada (Neilan et al., 1997). Figura 4. Procedimiento de amplificación y marcaje del cebador universal M13 (modificado de Arruda et al., 2010). 27 2.4.3 ESTUDIOS MOLECULARES EN LLAMAS Los estudios moleculares han permitido entre muchas cosas, conocer acerca del origen y biodiversidad de especies y/o poblaciones. Kadwell et al., (2001) realizaron análisis genéticos con ADN mitocondrial (ADNmt) y microsatélites con el fin de elucidar el origen de los CSA domésticos (alpacas y llamas); revelando fuertes similaridades entre la distribución del tamaño de alelos entre alpaca y vicuña, y entre llama y guanaco; afianzando la hipótesis que la alpaca proviene de la vicuña y el guanaco es el ancestro silvestre de la llama. Un análisis posterior de ADNmt (Barreta et al., 2012) confirma estas relaciones filogenéticas; sin embargo, pone de manifiesto que el proceso de domesticación de llamas y alpacas no ha ocurrido en una única población de camélidos salvajes, ni en una sola localización geográfica, sino que presenta un mayor grado de complejidad que el inicialmente descrito. Diversos estudios han determinado marcadores polimórficos de tipo microsatélite en llamas: Lang et al., (1996), estudiaron 20 llamas y 20 alpacas, obteniendo información para 15 loci microsatélite, mostrando una probabilidad de exclusión de paternidad de 99.996%. Así mismo, Penedo et al., (1999a, b), analizaron 155 llamas, 155 alpacas, y 102 guanacos, obteniendo información para 26 loci microsatélites. Sarno et al., (2000) trabajaron con llamas y guanacos analizando 6 loci microsatélites y reportaron probabilidades de exclusión acumuladas de 0.993 y 0.998 en llama y guanaco, respectivamente, valores que permiten su uso en pruebas de paternidad en ambas especies. Evdotchenko et al., (2003) reportaron 19 loci microsatélite en llama que también pueden ser aplicados en las diferentes especies de la familia Camelidae. En Argentina, Bustamante et al., (2002), estudiaron la diversidad genética de una población de llamas y dos de guanaco mediante el análisis de 6 loci microsatélite derivados de llama, calcularon parámetros genético poblacionales tales como: tamaño de los alelos, heterocigosidad promedio, equilibrio Hardy-Weinberg y distancias genéticas; demostrando la diferenciación entre llamas y guanacos de Argentina y reportando altos valores de diversidad genética. También aislaron y caracterizaron 5 marcadores microsatélites di nucleótidos polimórficos de llama y 5 de guanaco (Bustamante et al., 2003) y por último analizaron la variabilidad genética de tres poblaciones de llamas del noroeste argentino, afectadas a la producción de fibra, mediante amplificación por PCR de 12 loci microsatélite con cebadores 28 específicos de llama, observando nuevamente alta variabilidad genética (Bustamante et al., 2006) En Bolivia, Barreta et al., (2012) utilizaron 42 marcadores microsatélites para analizar la diversidad y estructura genética de 394 llamas distribuidas en 12 grupos regionales; encontrando altos niveles de: polimorfismo, de alelos y de heterocigosidades; y reportaron una débil diferenciación genética entre las poblaciones de llamas estudiadas. Así mismo, este estudió fue el primer trabajo a nivel molecular, que estimó la diferenciación genética entre los fenotipos de llamas Ch’aku y Ccara indicando que esta es muy baja (FST =0.003). En el Perú, la mayoría de estudios moleculares realizados en camélidos son especialmente en alpacas y vicuñas (Wheeler, 1995; Vallejo et al., 2008) y son escasos aquellos en llamas y en guanacos. Los estudios genéticos en llamas son básicamente limitados al análisis de parámetros cuantitativos de rasgos relacionados con el crecimiento y la fibra (Cristofanelli et al., 2005; Quispe et al., 2009). En el departamento de Junín; se estudió 50 llamas Ccara de fenotipo guanaco de Marcapomacocha, mediante análisis de ADN mitocondrial, revelando que las llamas tenían el haplotipo ancestral guanaco (Cano et al., 2012). 29 III. MATERIALES Y MÉTODOS El plan de trabajo consistió en tres fases: Fase de Campo, Fase de Laboratorio y Fase de Cálculo de Parámetros Genéticos. 3.1 FASE DE CAMPO Las muestras de sangre de llamas Ch’aku y Ccara fueron tomadas de la estación experimental ILLPA-INIA, anexo Quimsachata, donde se localiza el Banco de Germoplasma de Alpacas de color y Llamas, a una latitud 15 49' 23'' y longitud 70 39' 51'', en el distrito de Santa Lucía, provincia de Lampa, departamento de Puno. La ubicación está ilustrada usando el software DIVA-GIS versión 7.2.1 (Figura 5) Figura 5. Mapa DIVA-GIS del Banco de Germoplasma de Alpacas de Color y Llamas de Quimsachata. 30 Las muestras de sangre de llamas provinieron de dos rebaños separados geográficamente: Callacallani y Huayatani. Ambos conforman la población total de llamas de tipo Ch'aku y Ccara de Quimsachata. Callacallani está ubicado en la latitud 15° 48' 26'' y longitud 70° 39' 34'' a una elevación de 4166 m s n m., y presenta solamente llamas machos en ambos fenotipos. Mientras que Huayatani está ubicado en la latitud 15° 49' 23'' y longitud 70° 39' 51'' a una elevación de 4180 m s n m., y presenta solamente llamas hembras también de ambos fenotipos. El proceso de colecta de las muestras se describe a continuación: 1. Los animales fueron seleccionados al azar, y de cada uno se colectó 7 ml de sangre periférica a nivel del cuello en tubos Vacutainer con EDTA al 2.5 % (anticoagulante). En total se obtuvieron 251 muestras de sangre de llamas: 92 Ch’aku (67 hembras y 25machos) y 159 de llamas Ccara (109 hembras y 50 machos). 2. Se tomaron los datos de cada animal elegido: número de arete o código del animal, sexo (macho o hembra), color, fenotipo (Ch’aku o Ccara), se registró el número de foto y observaciones, como se muestra en el Cuadro 1 (Anexo 1). 3. Las muestras se mantuvieron refrigeradas y alejadas de la luz solar, para evitar la lisis de los glóbulos rojos, hasta su llegada al laboratorio de Biología Molecular y Genómica en la sede central del INIA en Lima, donde fueron refrigeradas a 4°C hasta su uso en la extracción del ADN. Cuadro 1. Ficha de Campo. Proyecto: "USO DE HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA LA CARACTERIZACIÓN DE RECURSOS GENÉTICOS" RESPONSABLES DE LA COLECTA: Eudosio Veli, Claudia FECHA: 24/08/2011 Yalta, Gabriela Paredes. DISTRITO: REBAÑO: CALLACALLANI/ SANTA PROVINCIA: LAMPA REGIÓN: PUNO HUAYATANI LUCÍA LATITUD: ___________ LONGITUD: ________ ALTURA: ______________ CÓDIGO NÚMERO Nº N° MUESTRA SEXO COLOR FENOTIPO OBSERVACIONES DE ARETE FOTO LABORATORIO 31 3.2 FASE DE LABORATORIO La fase de laboratorio se realizó en la institución del Laboratorio de Biología Molecular y Genómica de INIA. 3.2.1 EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE SANGRE El procedimiento de extracción de ADN a partir de las muestras de sangre de llamas Ch’aku y Ccara (Figura 6), se llevó a cabo mediante el protocolo establecido por Sambrook y Russell (2001), este fue modificado por el laboratorio de Biología Molecular y Genómica del INIA. Para cada muestra se realizó lo siguiente: a) Aislamiento de glóbulos blancos 1. El aislamiento de los glóbulos blancos se logró mediante lavados repetitivos y centrifugados con la solución de lisis Buffer Tris EDTA 20:5 v/v, (pH 8,0). Este proceso se repite hasta que el pellet este limpio. 2. El pellet de glóbulos blancos se guarda a -20C hasta que se realice el protocolo de aislamiento de ADN. b) Lisis de glóbulos blancos 1. Se añadió 750 μL de Buffer TE 20:5 a los glóbulos blancos aislados. Se agitó hasta disolver el pellet. 2. Se añadió 50 μL de detergente SDS al 10% y 12 μL de Proteinasa K, se mezcló suavemente por inversión para homogenizar, y luego se incubó en el Termobloque a 56°C por 3 horas. 3. Pasada las 3 h, se agregó 500 μL de acetato de K 3M, se refrigeró por 10 minutos a -20 °C. 32 4. Se centrifugó por 20 minutos a 14000rpm. El sobrenadante se separó en dos tubos que contenían isopropanol. Se invirtió suavemente para visualizar el pellet. Se centrifugó por 7 minutos a 14000rpm, y se eliminó el sobrenadante. 5. Se añadió 200 μL de etanol helado y las muestras fueron guardadas toda la noche a -20 °C. c) Extracción orgánica 1. Al día siguiente, las muestras fueron centrifugadas por 5 minutos a 14000rpm y el sobrenadante fue descartado. 2. Se añadió 300 μL de buffer TE 20:5 y 400 μL de la mezcla de solventes orgánicos cloroformo: alcohol isoamílico 24:1. La mezcla se agitó y centrifugó por 15 minutos a 14000rpm. 3. Se generan tres fases, de las cuales se recuperó solamente la fase superior que contiene el ADN resuspendido. Este sobrenadante fue trasladado a otro tubo de micro centrífuga de 1.5ml. d) Precipitación y lavado del ADN 1. Se agregó 200 μL de acetato de K 3M y luego 800 μL de etanol absoluto, los tubos se invierten suavemente para luego ser refrigerados a -20°C por 10 minutos. 2. Luego se centrifugan por 5 minutos a 14000 rpm, el sobrenadante es eliminado y se debe tener cuidado de no botar el pellet. 3. Se añadió 200 μL de buffer TE 20:5, 8 μL de NaCl 5M y 415 μL de etanol absoluto. Se mezcló suavemente por inversión. 4. Se centrifugó por 5 minutos a 14000rpm y se eliminó el sobrenadante, luego se agregó 300 μL de etanol al 70% (-20°C), nuevamente se mezclan, centrifugan y el sobrenadante se elimina. Se agregó 200 μL de etanol absoluto, se centrifugó y se eliminó el sobrenadante. Los tubos se dejaron secar a T° ambiente. 33 5. Finalmente, el precipitado se resuspendió en Buffer TE 10:1 (Tris-HCl 10Mm, EDTA 1.0Mm, pH 8.0). 3.2.2 CALIDAD Y CUANTIFICACIÓN DEL ADN EXTRAÍDO La cuantificación del ADN extraído se realizó por medio del equipo Epoch (Figura 6), de donde se obtiene la concentración de ADN expresada en ng/μl y la pureza del mismo por medio de la relación de absorbancia a 260nm sobre 280nm (260/280), dicha relación debe estar en un rango de 1.8-2.0 la cual indica que el ADN tiene una óptima calidad. El procedimiento consiste en adicionar, de cada muestra, 2 μl del ADN extraído a la placa del equipo, el cual permite la lectura de 15 muestras por placa y un blanco (buffer TE 10:1) para la calibración del equipo. a b Figura 6. a). Equipo Epoch para cuantificar ADN; b). Cargado de muestras para cuantificación. Luego de la cuantificación del ADN stock y de las diluciones (Anexo 2 y 3 respectivamente), se rectificó la calidad del ADN mediante electroforésis con geles de agarosa, usando 0.4g de agarosa con 40mL de buffer TE10X (Tris base, ácido bórico, EDTA 0.5M pH 8.0 y agua mili Q). A cada pocillo del gel se agrega una mezcla de 6 μl de buffer de carga Sal B (colorante azul de bromofenol, xilencianol, naranja G, sucrosa y agua mili Q) y 2 μl de ADN. De la misma manera se preparó el marcador de peso molecular, agregando en un tubo Eppendorf 3 μl de tampón de carga y 5 μl del marcador 100 pb ADN Ladder (Invitrogen). La corrida electroforética fue a 100 voltios por 20 minutos. 34 3.2.3 AMPLIFICACIÓN DE ADN MICROSATÉLITE Se utilizó un panel de trece marcadores microsatélites específicos de llamas y alpacas, elegidos por presentar alto contenido de información polimórfica (PIC), elevada heterocigosidad y diversidad genética en los estudios originales. El nombre de cada cebador seleccionado y sus características respectivas están detalladas en el Cuadro 2. La obtención de los fragmentos deseados de ADN, se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual replica de manera exponencial un segmento específico de ADN con el uso de una enzima termo-estable, Taq polimerasa (Mullis, 1990). Las muestras de ADN fueron amplificadas, con 13 marcadores microsatélite reportados internacionales y específicos para CSA; estos fueron elegidos por su alto valor de polimorfismo (PIC). El cebador forward presentó una secuencia adicional en su extremo 5’ de 19 pb, que pertenece al cebador M13 (CACGACGTTGTAAAACGAC), mientras que el reverse permaneció inalterado; asimismo se utilizó el cebador M13 marcado con fluorócromos: FAM, HEX y NED. Para la optimización de la PCR se seleccionaron al azar 8 muestras de ADN de sangre. Primero los microsatélites fueron amplificados por separado y luego se analizó cuáles de ellos podrían ser amplificados en una sola reacción (multiplex PCR) de acuerdo a su tamaño (pb), a su temperatura de alineamiento y a su concentración de MgCl2. La reacción de PCR se realizó en un Termociclador Eppendorf (modelo Mastercycler). Las combinaciones de los 13 microsatélites en reacciones en multiplex y simplex se presentan en el Cuadro 3. 35 Cuadro 2. Los cebadores y la secuencia M13, usados para amplificar regiones microsatélite en la población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata. Tamaño del Temperatura de Alineamiento MICROSATELITE Secuencia del cebador (5'->3') Referencias fragmento (pb) (°C) Cebador M13 CACGACGTTGTAAAACGAC 18 -- Packer et al., 2004 GLM4 F M13-TGAAGGAATGCAGATGAGAAGC 181-205 58 Bustamante et al., 2003 R TAGCTACAAACTTCCATGACAC LAB1 F M13-AGAGGATCAATCCCTCTGAGAT 161-189 58 Bustamante et al., 2003 R ATTAGAGGCCAGTATAACAATC LCA54 F M13-CACGTATACTTAAGAAGGG 147-157 58 Penedo et al., 1999a R CTGCAAGTTCGGAGAGAAA LCA65 F M13-TTTTTCCCCTGTGGTTGAAT 165-191 58 Penedo et al., 1999a R AACCTCAGCTGTTGTCAGGGG LCA77 F M13TGTTGACTAGAGCCTTTTCTTCTTT 233-263 58 Penedo et al., 1999a R GGGCAAGAGAGACTGACTGG LCA82 F M13-CGTGACACCAGGCTAAGTGA 108-124 58 Penedo et al., 1999b R TTTCAGATGGTAGCTTTAAAAATT LCA83 F M13-A TTCACCTTGCAGTTCCTGG 191-221 58 Penedo et al., 1999b R GACTCCAAGCAGGACGAGAC LCA85 F M13-CACGTATACAGACCAGAGAAGGG 194-210 58 Penedo et al., 1999b R CTGCAAGGGATTACGGAGAA LGU76 F M13-TTCCTTCCATTGAAGCAGGT 233-261 58 Sarno et al., 2000 R TGAGATGCACTGCTTTGGATA YWLL08 F M13-ATCAAGTTTGAGGTGCTTTCC 126-188 58 Lang et al., 1996 R CCATGGCATTGTGTTGAAGAC YWLL44 F M13-CTCAACAATGCTAGACCTTGG 81-130 58 Lang et al., 1996 R GAGAACACAGGCTGGTGAATA YWLL59 F M13-TGTGCAGGAGTTAGGTGTA 96-136 58 Lang et al., 1996 R CCATGTCTCTGAAGCTCTGGA VOLP03 F M13-AGACGGTTGGGAAGGTGGTA 129-169 56 Obreque et al., 1998 R CGACAGCAAGGCACAGGA 36 Cuadro 3. Combinaciones para reacciones en multiplex y simplex en PCR, rango (pb), marcaje y temperatura óptima de los microsatélites. Multiplex (M) Temperatura óptima MICROSATÉLITE Rango (pb) Fluorescencia Simplex (S) de alineamiento LCA82 108-124 58°C GLM4 147-157 58°C M1 FAM LCA54 181-205 58°C LGU76 233-261 58°C S1 YWLL44 81-130 HEX 58°C YWLL59 96-136 58°C M2 NED LAB1 161-189 58°C YWLL08 126-188 58°C M3 LCA85 194-210 FAM 58°C LCA77 233-263 58°C LCA65 165-191 58°C M4 HEX LCA83 191-221 58°C S2 VOLP03 129-169 NED 56°C Las amplificaciones por PCR fueron llevadas a cabo en reacciones de 10μL, el cual contenía 50ng de ADN. En los cuadros 4 y 5 se muestran las condiciones de la mezcla de amplificación de los cebadores. Las condiciones de PCR fueron: 95°C (5min), luego 35 ciclos a 95°C (30s)/ 58°C o 56°C (1'30s)/ 72°C (1'), seguido por una extensión final a 72°C por 30 minutos y luego a 4°C (∞). 37 Cuadro 4. Condiciones de Mezcla de amplificación del Grupo I (M1, S1 y M2). MULTIPLEX 1. Cebadores: LCA82, GLM4, Lgu 76, LCA54 Reactivos [ ] Stock [ ] Final 1 Rx H2O 5.2525 Buffer 10X 1X 1 dNTPs 2.5mM 0.2mM 0.8 MgCl2 50mM 2.5mM 0.5 LCA 82 F 20uM 0.025uM 0.0125 LCA 82 R 20uM 0.05uM 0.025 GLM 4 F 20uM 0.02uM 0.0125 GLM 4 R 20uM 0.04uM 0.025 Lgu 76 F 20uM 0.02uM 0.0125 Lgu 76 R 20uM 0.04uM 0.025 LCA54 F 20uM 0.1uM 0.05 LCA54 R 20uM 0.2uM 0.1 M13-FAM 20uM 0.2uM 0.1 Taq Pol 5U/ml 0.25U/ml 0.1 ADN 35ng/Ul 50ng 2 Vol. Final 10 SIMPLEX 1. Cebadores: YWLL44 Reactivos [ ] Stock [ ] Final 1 Rx H2O 5.52 Buffer 10X 1X 1 dNTPs 2.5mM 0.2mM 0.8 MgCl2 50mM 2.5mM 0.5 YWLL44F 20uM 0.02uM 0.01 YWLL44R 20uM 0.04uM 0.02 M13-HEX 20uM 0.1uM 0.05 Taq Pol 5U/ml 0.25U/ml 0.1 ADN 35ng/Ul 50ng 2 Vol. Final 10 38 MULTIPLEX 2. Cebadores: YWLL59, LAB1 Reactivos [ ] Stock [ ] Final 1 Rx H2O 5 Buffer 10X 1X 1 dNTPs 2.5mM 0.2mM 0.8 MgCl2 50mM 2.5mM 0.5 YWLL59F 20uM 0.1uM 0.05 YWLL59R 20uM 0.2uM 0.1 LAB1F 20uM 0.1uM 0.05 LAB1R 20uM 0.2uM 0.1 M13-NED 20uM 0.2uM 0.1 Taq Pol 5U/ml 0.25U/ml 0.3 ADN 35ng/Ul 50ng 2 Vol. Final 10 Cuadro 5. Condiciones de Mezcla de amplificación del Grupo II (M3, M4 y S2) MULTIPLEX 3. Cebadores: YWLL08, LCA85, LCA77 Reactivos [ ] Stock [ ] Final 1 Rx H2O 5.41 Buffer 10X 1X 1 dNTPs 2.5mM 0.2mM 0.8 MgCl2 50mM 3.0mM 0.6 YWLL08 F 20uM 0.02uM 0.01 YWLL08 R 20uM 0.04uM 0.02 LCA85 4 F 20uM 0.02uM 0.01 LCA85 R 20uM 0.04uM 0.02 LCA77 F 20uM 0.02uM 0.01 LCA77 R 20uM 0.04uM 0.02 M13-FAM 20uM 0.2uM 0.1 Taq Pol 5U/ml 0.25U/ml 0.1 ADN 35ng/Ul 50ng 2 Vol. Final 10 39 MULTIPLEX 4. Cebadores: LCA65, LCA83 Reactivos [ ] Stock [ ] Final 1 Rx H2O 5.44 Buffer 10 X 1X 1 dNTPs 2.5mM 0.2mM 0.8 MgCl2 50mM 3.0mM 0.6 LCA65F 20uM 0.02uM 0.01 LCA65R 20uM 0.04uM 0.02 LCA83F 20uM 0.02uM 0.01 LCA83R 20uM 0.04uM 0.02 M13-HEX 20uM 0.2uM 0.1 Taq Pol 5U/ml 0.25U/ml 0.1 ADN 35ng/Ul 50ng 2 Vol. Final 10 SIMPLEX 2. Cebador: VOLP03 Reactivos [ ] Stock [ ] Final 1 Rx H2O 5.37 Buffer 10 X 1X 1.1 dNTPs 2.5mM 0.2mM 0.88 MgCl2 50mM 1.5mM 0.33 VOLP03F 20uM 0.02uM 0.055 VOLP03R 20uM 0.04uM 0.11 M13-NED 20uM 0.2uM 0.055 Taq Pol 5U/ml 0.25U/ml 0.1 ADN 35ng/Ul 50ng 3 Vol. Final 10 40 3.2.4 USO DEL ANALIZADOR GENÉTICO PARA ELECTROFORÉSIS CAPILAR Una vez obtenidos todos los productos amplificados se realizó una electroforesis capilar en un secuenciador automático ABI Prism 3130XL Genetic Analizer® (Applied Biosystem) (Figura 7). Para ello, previamente se determinó dos paneles o grupos de marcadores: GI (7 marcadores SSR) y GII (6 marcadores SSR), en función de la combinación de los fluorócromos: FAM (azul), HEX (verde) y NED (amarillo) (Cuadro 6), estos grupos corrieron por separado en el Analizador Genético. Cada panel está compuesto de tres colores lo que permite ordenar los marcadores de acuerdo al tamaño del fragmento para evitar solapamiento de las bandas al analizarlos con el secuenciador. a b Figura 7. a). Preparación de muestras para electroforesis capilar; b). Cargado de placa de en el Analizador Genético ABI 3130XL. Para el proceso de detección de las muestras en el ABI 3130XL se utilizó placas de 96 pozos donde se combinaron 2µL de cada producto amplificado (multiplex o simplex) con 9.7µL de Formamida doblemente desionizada (Hi-Di) y 0.3µL del marcador estándar de tamaño ROX (Applied Biosystems), para un volumen final de 16 µl por reacción de cada grupo. La muestra en la placa se desnaturalizó a 94°C durante tres minutos y luego colocadas a -20°C por 3 minutos, para que finalmente fuese leída por capilaridad, donde la exposición de los fragmentos a un láser provoca la emisión de fluorescencia que es captada por una cámara 41 digital transformando la imagen en picos de fluorescencia y analizados con el software GeneMapper v.3.7. El medio de electroforésis fue el polímero: Performance Optimized Polymer 7 (POP-7) (Applied Biosystems), compuesto por dimetilacrilamida, urea 8M, 2-pirrolidinona al 5% y EDTA 1Mm, que establece un entorno altamente desnaturalizante para las muestras de ADN a temperatura de 60°C a la que se llevó a cabo la electroforésis. Cuadro 6. Grupos asignados para el Analizador Genético según su fluorescencia y volumen usado en el Analizador de cada reacción Multiplex (M) y/o simplex (S). Grupo en el Multiplex(M)/ Volumen de Analizador Marcador Fluorescencia Simplex (S) carga (µL) Genético LCA82 GLM4 M1 FAM 2 LCA54 GI LGU76 S1 YWLL44 HEX 2 YWLL59 M2 NED 2 LAB1 YWLL08 M3 LCA85 FAM 2 LCA77 GII LCA65 M4 HEX 2 LCA83 S2 VOLP03 NED 2 42 3.2.5 ANÁLISIS DE DATOS La visualización de los picos obtenidos a partir de los marcadores microsatélites marcados con el cebador M13 fluorescente, el análisis de los fragmentos y la obtención de la información del tamaño de los alelos estudiados en pares de bases, fue llevado a cabo mediante el software GeneMapper v 4.0 (Applied Biosystems) (Figura 8) el cuál muestra picos del color correspondiente a cada uno de los marcadores: azul (FAM), verde (HEX) y amarillo (NED) que se observa de color negro para una mejor definición. El software GeneMapper determina el tamaño de los fragmentos generados en la PCR comparando los picos de fluorescencia generados con el estándar de tamaño ROX. La altura de cada pico es proporcional a la cantidad de fluorescencia detectada, que en cierto modo, reflejaba la cantidad del fragmento de ADN presente en la electroforésis. Para evitar errores de genotipado las muestras fueron repetidas. Después, el software GeneMapper permite descargar los datos de los alelos para cada genotipo en cada uno de los loci, organizándose en un archivo Excel Microsoft® office. Figura 8. Electroferograma de los marcadores amplificados. 43 3.3 FASE DE ANÁLISIS DE PARÁMETROS GENÉTICOS POBLACIONALES 3.3.1 ANÁLISIS DE DIVERSIDAD ALÉLICA A partir de los datos obtenidos de la genotipificación con el programa GeneMapper 4.0, se realizó el análisis de la diversidad alélica utilizando los programas estadísticos Cervus 3.0.3 (Marshall et al., 1998), Genepop 4.0.11 (Raymond y Rousset 1995) y Genetix 4.0.5 (Belkhir et al., 2003). Se calculó los parámetros estadísticos más empleados para cuantificar la variabilidad genética para los 13 marcadores microsatélites: número de individuos analizados, número de alelos encontrados por locus y sus frecuencias alélicas, número medio de alelos por locus, heterocigosidad esperada (He) y heterocigosidad observada (Ho) y contenido de información polimórfico (PIC) (Aranguren et al., 2001). a. Frecuencias alélicas Para el cálculo de las frecuencias alélicas de cada locus se ha utilizado el programa Cervus 3.0.3. Esta se refiere a la proporción de un determinado alelo en relación al total de alelos de la población. El cálculo de las frecuencias se hace por recuento directo de los alelos frecuentes, asumiendo que la observación de un solo alelo se corresponde con la condición de homocigósis (Estévez 2009). b. Heterocigosidad esperada La heterocigosidad esperada (He) desde el punto de vista matemático, es la probabilidad de que dos alelos tomados al azar de la población sean diferentes (Crow y Kimura 1970) y es un indicador del nivel de información del locus. Por debajo de 0,5 esta se considera insuficiente (Fendri, 2008). Se calculó a partir de la frecuencia de cada uno de los alelos asumiendo el equilibrio de Hardy-Weinberg (Nei, 1978) que establece que la composición genética de una población natural permanece en equilibrio mientras no actúen la selección natural, ni ningún otro factor como la mutación o la deriva, con la siguiente fórmula: Donde: xi: frecuencia del alelo i y k: número de alelos 44 c. Heterocigosidad observada La heterocigosidad observada (Ho) es la proporción de organismos heterocigotos calculada a partir de los genotipos observados en una muestra poblacional. Si se calcula a partir de los genotipos encontrados en la población para todos los loci se denomina heterocigosidad media observada (Cruz, 2003). d. Contenido de información polimórfica El Contenido de Información Polimórfica (PIC) fue calculado a partir del número de alelos y las frecuencias alélicas mediante el programa Cervus 3.0.3, según (Botstein et al., 1980). El PIC representa las posibles combinaciones entre los distintos alelos obtenidos y un índice de la capacidad informativa de cada uno de los microsatélites (Fendri, 2008). Los marcadores con valores de PIC superiores a 0.5 se consideran muy informativos, los que tienen valores entre 0.25 y 0.5 medianamente informativos y los que muestran valores inferiores a 0.25 poco informativos (Botstein et al., 1980). 3.3.2 EQUILIBRIO HARDY-WEINBERG En una población infinita donde los cruzamientos se producen de manera aleatoria en ausencia de mutación, migración y selección, las frecuencias alélicas y genotípicas no varían de generación en generación. Las poblaciones se encuentran en esta situación se dicen que están en equilibrio Hardy-Weinberg (Hardy, 1908). Se realizó un análisis de la desviación con respecto al equilibrio Hardy-Weinberg ya sea por exceso ó déficit de heterocigotos y homocigotos en la población total y dentro de cada población. Para llevar a cabo este análisis se obtuvieron dos estadísticos: FIS de Weir y Cockerham (1984) y los estadísticos FIS de Robertson y Hill (1984), mediante el programa Genepop 4.0.11 la prueba del FIS sobre 5000 permutaciones para todos los loci utilizados en las poblaciones. En un estudio sobre variación genética debe determinarse si hay desviaciones significativas del equilibrio Hardy-Weinberg en los loci estudiados. Puesto a que, cualquier desviación significativa indicará que la población está subdividida, que existe una consanguinidad 45 significativa o que existe un flujo de genes de otra población. Las desviaciones del equilibrio HW pueden producirse debido a varios factores (Darío, 2008): a. Los apareamientos no se producen al azar. b. Coancestros, antepasados comunes. c. Selección natural (ventaja de los heterocigotos). d. Migración o flujo de genes desde una población externa. e. Diferencias sexo-específicas en las frecuencias alélicas. f. Técnica de muestreo incorrecta. g. Presencia de alelos nulos no detectables experimentalmente. 3.3.3 ALELOS NULOS La frecuencia de los alelos nulos es una de las principales causas de desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg (Pemberton et al., 1995). Su presencia puede deberse a que uno o ambos sitios de unión de los iniciadores han sufrido mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos de ADN, lo que impide la amplificación; para confirmar que se trata de alelos nulos la estrategia sugerida es el diseño de nuevos iniciadores que reconozcan secuencias alternativas cercanas al microsatélite (Callen y Thompson, 1993). Esto produce errores en el genotipado de los individuos al considerar individuos homocigotos como heterocigotos, lo que altera los análisis posteriores que se realicen. La frecuencia de alelos nulos (F0) es un indicador importante de la garantía de los resultados del análisis de microsatélites, sobre todo en estudios genéticos de una población y fue calculada mediante el programa Cervus 3.0.3. Cuando la heterocigosidad esperada es inferior o igual a la heterocigosidad observada, la frecuencia de alelos nulos es entonces negativa o cero. En este caso, se puede concluir que el análisis realizado refleja realmente la variabilidad de la población, en caso contrario la presencia de alelos nulos disminuye la heterocigosidad esperada y en consecuencia resulta en una sobreestimación del nivel de homocigosidad. De esta forma, al observar un individuo homocigoto no se sabe si es homocigoto realmente o si se trata de heterocigoto para un alelo nulo (Fendri, 2008). 46 3.3.4 DIVERSIDAD GENÉTICA DE NEI Utilizando el programa Fstat v 2.9.3.2 (Goudet 1995), se calculó la diversidad genética de Nei para cada una de las poblaciones utilizando los 13 marcadores microsatélites analizados. La diversidad genética de Nei (1973), generalmente se obtiene a partir de  = 1 - 2 ∑pi donde,  es la heterocigosidad esperada, y pi es la frecuencia del alelo ith alelo de un locus en una población y xi es la frecuencia alélica correspondiente de la muestra extraída de la población (Vallejo, 2008). Sin embargo, este procedimiento sería el más adecuado si la muestra poblacional fuera realmente grande. Debido a esto, el análisis utilizado es el de Nei (1978) ya que mide los niveles de diversidad genética por medio de un procedimiento insesgado a partir de la heterocigosidad esperada el cual permite hacer análisis de muestras que no presentan un gran tamaño: 2 h=2n (1-∑xi )/ (2n-1) Donde n es el número de individuos de la muestra y x es la frecuencia del alelo i en dicha muestra. De acuerdo a esto, se obtuvo la heterocigosidad genética insesgada de la población: Ĥ = Σ hk / r Donde hk es el valor de h para el kth locus y r son los loci analizados en la población. 47 3.3.5 ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA GENÉTICA DE LAS POBLACIONES a. Estadísticos F de Wright Los indicies de fijación de Wright (1978): FIS, FST y FIT permiten conocer la estructura poblacional tanto en situaciones en las que exista selección como en aquellas en que no haya porque los términos se encuentran definidos por las frecuencias alélicas y genotípicas de la población en un momento concreto (Nei, 1973). Los estadísticos de diferenciación poblacional fueron obtenidos por medio del programa Fstat v 2.9.3.2.  FIS: Índice que mide la desviación de las frecuencias genotípicas observadas en las subpoblaciones respecto a las esperadas considerando equilibrio HW.  FST: Índice que mide el grado de diferenciación genética entre subpoblaciones, su interpretación es sencilla: si es de 0, indica que las frecuencias alélicas son iguales en todas las poblaciones, no ha habido diferenciación. El máximo posible es de 1, cuando cada población está fija en alelos diferentes (Piñero, 2008). Wright (1978) sugirió unas pautas generales para la interpretación del FST, de acuerdo con las cuales: 0 ≤ FST < 0.05 indicaría poca diferenciación genética. 0.05 ≤ FST < 0.15 indicaría una diferenciación moderada. 0.15 ≤ FST < 0.25 indicaría una gran diferenciación. 0.25 ≤ FST indicaría una diferenciación muy grande.  FIT: coeficiente de endogamia, mide el déficit de heterocigosidad global y la desviación de las frecuencias genotípicas observadas en la población total con respecto a las esperadas considerando el equilibrio HW. 48 b. Análisis de varianza molecular La variabilidad genética total se debe a la contribución de diferentes fuentes, el análisis de varianza molecular (AMOVA) nos permite cuantificar de qué manera cada una contribuye a la variabilidad total (Cortes, 2008). Se analizó la varianza molecular entre individuos, entre poblaciones y dentro de las poblaciones utilizando el programa Arlequín 3.1 (Excoffier et al., 2005). 2 Los componentes de varianza (σi ) son utilizados para calcular los índices de fijación, análogos a los estadísticos F definidos originalmente por Wright (1965), que reflejan la correlación de la diversidad a diferente niveles jerárquicos de división (Slatkin, 1995). La 2 varianza molecular total (σ ) es la suma de los componentes de varianza debido a diferencias 2 entre haplotipos dentro de una población (σc ), el componente de varianza debidos a 2 diferencias entre haplotipos en diferentes poblaciones dentro de un grupo (σb ) y el componente de varianza debido a diferencias entre los haplotipos de los diferentes grupos 2 (σa ) (Cortes, 2008). c. Análisis de la estructura de población La estructura genética de la población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata fue analizada mediante el programa STRUCTURE (Pritchard et al., 2000). Con este programa se hace un análisis de agrupamiento de los individuos estudiados en un diferente número de clusters (K) que representarían el número de poblaciones asumidas utilizando un modelo de mezcla en el cual cada individuo podría contener en su genoma porcentajes variables de las poblaciones ancestrales de las que proviene (Estévez, 2009). Formalmente, el método consiste en utilizar la información molecular de los individuos analizados. Se espera que individuos de una misma raza o población tengan una composición similar de su genoma en cuanto a proporción de origen en los distintos clusters. El programa permite obtener una representación grafica de estas composiciones, de forma que se puedan apreciar parecidos o diferencias entre individuos dentro de una misma población o entre distintas poblaciones (Cortes, 2008). 49 3.3.6 FLUJO GÉNICO El flujo génico o migración se refiere a todos los mecanismos que resultan en el movimiento de genes de una población a otra. Es un importante componente de la estructura poblacional, ya que sus patrones y niveles determinan hasta qué grado cada población de una especie es una unidad evolutiva independiente (Slatkin 1995). Una medida que resulta fácil de calcular y conceptualmente útil es el Número de Migrantes (Nm). Si Nm es mayor que 1, teóricamente el flujo génico supera los efectos de la deriva génica y previene la diferenciación local. Si Nm es menor que 1 entonces se puede decir que la deriva actúa independientemente en cada una de las poblaciones, y si es mayor de 4 entonces las poblaciones se comportan como una gran población más o menos panmíctica (Piñero, 2008). 3.3.7 ANÁLISIS FACTORIAL DE CORRESPONDENCIA Genetix v 4.05 cuenta con una herramienta que permite establecer un análisis factorial de correspondencias (AFC). Este procedimiento describe la asociación de variables cualitativas, en la que cada individuo está representado sólo una vez por el valor de cada modalidad (locus) y variable (alelos para cada locus). En este caso, los individuos analizados vienen de poblaciones y están representados por los valores propios de sus frecuencias alélicas; los valores de inercia en cada eje pueden ser interpretados como combinaciones lineales de los valores FST (varianza de frecuencias alélicas entre poblaciones). Los resultados son mostrados como gráficas bidimensionales o tridimensionales en las que los individuos se ven como nubes de puntos en el hiperespacio, que tiene tantas dimensiones como modalidades (alelos) haya en todas las variables (alelos en los diferentes loci) y la relación que guarda con respecto a los demás individuos está en función de la distancia que existe entre ellos (Belkhir et al., 2003). 50 IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES 4.1 FASE DE ANÁLISIS DE PARÁMETROS GENÉTICOS POBLACIONALES Se ha realizado la caracterización genética de las llamas Ch’aku y Ccara del Banco de Germoplasma de Alpacas color y Llamas del ILLPA- INIA anexo Quimsachata, mediante los resultados del análisis de trece marcadores microsatélites con la metodología del cebador universal M13, en una muestra de 251 animales. Esta metodología ha permitido visualizar un tamaño preciso de los alelos y es una buena herramienta para la genotipificación y el análisis de la diversidad genética. Además es más económica comparando con la metodología de cebadores marcados directamente con fluorescencia. El análisis de diversidad alélica realizado con el programa Cervus 3.0.3 y corroborado con los programas Genepop 4.0.11 y Genetix 4.0.5, mostró que el número de alelos por locus fue similar en ambas poblaciones. Se observó un total 157 alelos diferentes en los 13 loci tipificados y un promedio de 12.08 alelos por locus, lo que representa una diversidad alélica elevada. Los marcadores LCA54, LCA83 y LCA85 (Penedo et al., 1999a, b) presentaron el menor número de alelos: 8. Mientras que los marcadores YWLL08 y YWLL59 (Lang el al. 1998) presentaron el mayor número de alelos: 19. Se observó 137 alelos en la población de llamas Ch’aku y 142 alelos en la población de llamas Ccara (Cuadro 7). En la población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata, se encontró alelos no reportados anteriormente. Por ejemplo, Lang et al., (1996), identificaron en los marcadores YWLL08, YWLL44 y YWLL59: 13, 11 y 10 alelos respectivamente; mientras que en el presente estudio se encontró 19, 17 y 19 alelos respectivamente. Así mismo, Penedo et al., (1999a, b), encontraron en los marcadores LCA82 y LCA83: 5 y 7 alelos respectivamente. 51 Sin embargo para los marcadores LCA65 y LCA77 reportaron 14 y 15 alelos respectivamente, más de lo reportado en el presente estudio. Al igual que Penedo, el marcador LCA85 reportó 8 alelos en la población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata. Sarno (2000) identificó 8 alelos en el marcador Lgu76, pero en el presente estudio se encontró 15. En Argentina, Bustamante et al., (2006) encontraron en total en tres poblaciones de llamas, 10 alelos para el marcador LCA77 y 9 alelos para LCA65. En cuanto a los marcadores LAB1 y GLM4, reportaron 9 alelos para cada marcador. Barreta et al., (2012), analizaron 394 llamas con 42 marcadores microsatélites entre ellos los marcadores microsatélite: LCA77, LCA83, LCA85, YWLL08 y YWLL44 con una cantidad en el número de alelos de: 12, 11, 10, 28 y 20 alelos respectivamente. Cuadro 7. Número de alelos por locus en cada población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata. POBLACIÓN Locus N A CH'AKU CCARA GLM4 246 9 10 10 LAB1 245 13 13 14 LCA54 247 4 8 8 LCA65 236 8 8 9 LCA77 241 8 10 11 LCA82 246 9 7 9 LCA83 237 8 7 8 LCA85 240 8 7 8 LGU76 246 14 14 15 YWLL08 239 17 17 19 YWLL44 225 15 16 17 YWLL59 246 15 17 19 VOLP03 227 9 8 10 Media 240.077 10.54 10.92 12.08 TOTAL 251 137 142 157 52 4.1.1 FRECUENCIAS ALÉLICAS Los siguientes histogramas representan las frecuencias alélicas de cada alelo de los 13 loci microsatélites estudiados, por población. Mediante el programa Cervus 3.0.3 se calculó el porcentaje de homocigotos de cada población. GLM4 La Figura 9 indica las frecuencias alélicas del marcador GLM4, el cual presenta un número total de 10 alelos. El alelo con mayor frecuencia es el 216, en ambas poblaciones. La población de llamas Ccara presentó un alelo privado (214). En la población de llamas Ch’aku el porcentaje de homocigotos fue 33.71 por ciento, y en la población de llamas Ccara fue 24.20 por ciento. Figura 9. Frecuencias alélicas del marcador GLM4 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. LAB1 La Figura 10 indica las frecuencias alélicas del marcador LAB1, mostrando alta diversidad alélica: un total de 14 alelos diferentes. El alelo con mayor frecuencia en ambas poblaciones es el 189. Se observó la presencia de un alelo privado tanto en la población de llamas Ch’aku como en la población de llamas Ccara: alelo 177 y 203 respectivamente. En la población de llamas Ch’aku el porcentaje de homocigotos fue 27.91 por ciento, mientras que en la población de llamas Ccara fue de 29.56 por ciento. 53 Figura 10. Frecuencias alélicas del marcador LAB1 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. LCA54 La Figura 11 indica las frecuencias alélicas del marcador LCA54, este es uno de los marcadores con la menor diversidad alélica en el Banco de Germoplasma de Quimsachata, ya que presenta un número total de 8 alelos, mostrando una mayor frecuencia de los alelos 167 y 169 en ambas poblaciones. La población de llamas Ccara presenta cuatro alelos privados (159, 171, 173 y 179). En la población de llamas Ch’aku el porcentaje de homocigotos fue elevado: 40 por ciento, al igual que en la población de llamas Ccara: 47.13 por ciento. Figura 11. Frecuencias alélicas del marcador LCA54 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. 54 LCA65 La Figura 12 indica las frecuencias alélicas del marcador LCA65. El cual presenta un número total de 9 alelos. Mostrando una mayor frecuencia del alelo 188. Cada una de las poblaciones presentó un alelo privado: Ch’aku (202) y Ccara (200). En la población de llamas Ch’aku el porcentaje de homocigotos fue 39.53 por ciento, mientras que en la población de llamas Ccara fue 39.07 por ciento. Figura 12. Frecuencias alélicas del marcador LCA65 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. LCA77 La Figura 13 indica las frecuencias alélicas del marcador LCA77. Este marcador presenta un número total de 11 alelos diferentes. Mostrando una mayor frecuencia del alelo 258 en ambas poblaciones. La población de llamas Ccara presenta tres alelos privados (256, 262 y 278) y uno en las llamas Ch’aku (264). En la población de llamas Ch’aku el porcentaje de homocigotos fue 34.48 por ciento mientras que en la población de llamas Ccara fue 32.90 por ciento. 55 Figura 13. Frecuencias alélicas del marcador LCA77 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. LCA82 La Figura 14 indica las frecuencias alélicas para el locus LCA82, el cual presenta 9 alelos en total, mostrando una mayor frecuencia del alelo 124. Se puede apreciar la diferencia de las frecuencias alélicas entre ambas poblaciones. Solamente se encontró dos alelos privados (126 y 132) y corresponden a la población de llamas Ch’aku. El porcentaje de homocigotos en la población de llamas Ch’aku y Ccara fue: 31.82 y 48.41 por ciento, respectivamente. Figura 14. Frecuencias alélicas del marcador LCA82 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. 56 LCA83 En a Figura 15 se observa las frecuencias alélicas del marcador LCA83, el cual presenta un número total de 8 alelos diferentes. Mostrando una mayor frecuencia del alelo 220 y una distribución alélica que permite diferenciar la mayoría de los tamaños de alelos obtenidos para este marcador en ambas poblaciones. Solo hay la presencia de un alelo privado que corresponde a la población Ch’aku (216). En la población de llamas Ch’aku el porcentaje de homocigotos fue elevado: 34.48 por ciento mientras que en la población de llamas Ccara fue 32.90 por ciento. Figura 15. Frecuencias alélicas del marcador LCA83 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. LCA85 La Figura 16 indica las frecuencias alélicas del marcador LCA85, mostrando una mayor frecuencia de los alelos 212 en ambas poblaciones y 218 principalmente en las llamas Ccara. Este marcador presentó un número total de 8 alelos diferentes. Se aprecia una pequeña diferencia entre las frecuencias de la población de llamas Ch’aku y Ccara, y solo la población Ch’aku tiene un alelo privado (214). En la población de llamas Ch’aku y Ccara el porcentaje de homocigotos fue: 21.18 y 25.81 por ciento, respectivamente. 57 Figura 16. Frecuencias alélicas del marcador LCA85 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. LGU76 La Figura 17 indica las frecuencias alélicas del marcador LGU76, el cual presenta un número total de 15 alelos diferentes. Los alelos con mayor frecuencia son 237 y 255 y también las dos poblaciones presentan solamente un alelo privado: 279 (Ccara) y 285 (Ch’aku). En la población de llamas Ch’aku y Ccara el porcentaje de homocigotos fue: 17.05 y 25.00 por ciento, respectivamente. Figura 17. Frecuencias alélicas del marcador LGU76 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. 58 YWLL08 La Figura 18 muestra las frecuencias alélicas del marcador YWLL08, el cual presenta un número total de 19 alelos diferentes. Este marcador mostró dos alelos privados en cada población: 157 y 189; y 181 y 201 en la población de llamas Ccara y Ch’aku respectivamente. En la población de llamas Ch’aku el porcentaje de homocigotos fue 9.78 por ciento y el de la población de llamas Ccara fue 16.98 por ciento. Figura 18. Frecuencias alélicas del marcador YWLL08 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. YWLL44 La Figura 19 muestra las frecuencias alélicas para el marcador YWLL44. Es un marcador con alta diversidad alélica y las frecuencias alélicas de todos sus alelos son bajas. El alelo con mayor frecuencia es el 129 en ambas poblaciones. Presenta un número total de 17 alelos diferentes. En la población de llamas Ch’aku se encontró un alelo privado (127), mientras que en la población de llamas Ccara se encontró dos (133 y 143). En la población de llamas Ch’aku y Ccara el porcentaje de homocigotos fue: 16.30 y 15.09 por ciento, respectivamente. 59 Figura 19. Frecuencias alélicas del marcador YWLL44 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. YWLL59 La Figura 20 muestra las frecuencias alélicas del marcador YWLL59. Este marcador junto con YWLL08 presenta la mayor diversidad alélica del Banco de Germoplasma de Quimsachata: un número total de 19 alelos diferentes. El alelo con mayor frecuencia es el 112 para ambas poblaciones. En la población de llamas Ccara se encontró cuatro alelos privados (138, 142, 148 y 150), mientras que en la población de llamas Ch’aku se encontró dos alelos privados (102 y 114). En la población de llamas Ch’aku y Ccara el porcentaje de homocigotos fue: 27.06 y 25.48 por ciento, respectivamente. 60 Figura 20. Frecuencias alélicas del marcador YWLL59 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. VOLP03 En a Figura 22 se observa las frecuencias alélicas del marcador VOLP03. Este marcador presenta un total de 10 alelos diferentes. Mostrando una mayor frecuencia de los alelos 175 y 177. La población de llamas Ch’aku presentó dos alelos privados: 153, 171 y la población de llamas Ccara uno: 191 En la población de llamas Ch’aku y Ccara el porcentaje de homocigotos fue: 26.19 y 41.5 por ciento, respectivamente. Figura 21. Frecuencias alélicas del marcador VOLP03 en las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. 61 El porcentaje total de homocigotos de las poblaciones Ch’aku y Ccara fue: 26.86 y 30.37 por ciento. En total se observaron 35 alelos privados, de los cuales 15 corresponden a la población de llamas Ch’aku y 20 a la población de llamas Ccara. Cabe mencionar que todas sus frecuencias génicas fueron bajas (<0.05). El marcador con mayor número de alelos privados fue YWLL59 (6). 4.1.2 HETEROCIGOSIDAD ESPERADA Y OBSERVADA El cálculo de las frecuencias alélicas permitió determinar, mediante los programas Fstat 2.9.3.2 y Cervus 3.0.3, la heterocigosidad esperada (He) y observada (Ho) total y de cada población de los 13 marcadores microsatélites. En el Cuadro 8 se observa que la He es en general más alta que la Ho (He>Ho). Los valores de He y Ho en las llamas Ch’aku son mayores que los valores de He y Ho en las llamas Ccara: 0.772>0.744; y 0.731>0.693, respectivamente. Esto se explica porque el porcentaje de heterocigotos total para los trece locus es de 73.14 y 69.33 por ciento para la primera y segunda población, respectivamente. Los marcadores GLM4, LCA82 y YWLL59 son aquellos que presentan la mayor diferencia entre He y Ho en la población de llamas Ch’aku. Los marcadores LCA82 y YWLL59 se comportan de igual manera en la población de llamas Ccara. Por lo tanto, estos marcadores son los que más contribuyen con el déficit de heterocigosidad global. Los marcadores LCA77, LCA83 y VOLP03 presentan un valor mayor de Ho respecto a la He (Ho>He) solamente en la población de llamas Ch’aku, por tanto se asume que para estos marcadores en esta población, se produjeron menos apareamientos endogámicos de lo que se espera por azar. El valor máximo de He en la población total corresponde al locus YWLL08 (0.893), mientras que la He más baja fue para el marcador LCA54 (0.587), que corresponde también a uno de los loci con menor número de alelos totales. La He total tuvo un promedio de 0.758. 62 Igualmente, la Ho en la población total varió en el rango de 0.555 (LCA54) a 0.857 (YWLL08) con un promedio de 0.707. Estos resultados son comparables con aquellos análisis de población de llamas en Argentina y Bolivia (Bustamante, et al., 2002, 2006; Barreta et al, 2012). En todos estos trabajos, al igual que en el presente estudio, la heterocigosidad esperada fue siempre mayor que la observada. Cuadro 8. Valores de He y Ho en cada población y en la población total de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata. POBLACIÓN CH'AKU CCARA TOTAL Locus A He Ho He Ho He Ho GLM4 10 0.775 0.663 0.784 0.758 0.783 0.724 LAB1 14 0.789 0.721 0.732 0.704 0.756 0.71 LCA54 8 0.613 0.6 0.557 0.529 0.587 0.555 LCA65 9 0.648 0.605 0.639 0.609 0.643 0.608 LCA77 11 0.641 0.655 0.683 0.671 0.669 0.665 LCA82 9 0.786 0.682 0.715 0.516 0.746 0.576 LCA83 8 0.777 0.788 0.742 0.724 0.762 0.747 LCA85 8 0.848 0.759 0.805 0.742 0.824 0.748 LGU76 15 0.842 0.83 0.792 0.75 0.814 0.779 YWLL08 19 0.914 0.902 0.871 0.83 0.893 0.857 YWLL44 17 0.878 0.837 0.87 0.849 0.875 0.845 YWLL59 19 0.844 0.729 0.835 0.745 0.838 0.74 VOLP03 10 0.685 0.738 0.643 0.585 0.659 0.641 Media 12.08 0.772 0.731 0.744 0.693 0.758 0.707 A = número de alelos diferentes detectados en cada población; He: heterocigosidad esperada, Ho: heterocigosidad observada. 63 4.1.3 CONTENIDO DE INFORMACIÓN POLIMÓRFICA El contenido de información polimórfica (PIC) fue calculado mediante el software estadístico Cervus 3.0.3 y depende tanto del número de alelos como de la distribución de sus frecuencias en la población. Considerando que un valor de PIC superior a 0,50 indica que un marcador es muy informativo, se afirma que todos los locus analizados fueron polimórficos y siendo los microsatélites más informativos: YWLL08 (0.883), YWLL44 (0.863), YWLL59 (0.819), y LCA85 (0.8), y el menos informativo LCA54 (0.517). En total el promedio obtenido del PIC fue de 0.724. El PIC, muestra un valor promedio de 0.736 para la población de llamas Ch’aku, mientras que la población de llamas Ccara posee un valor promedio más bajo de 0.707, pero igualmente informativo. Los marcadores que presentan los valores más altos de PIC también presentan elevados valores en el número de alelos y en la heterocigosidad observada. Algunos marcadores muestran un PIC bajo aunque su número de alelos es alto como por ejemplo VOLP03 (0.593) con 10 alelos y LCA65 (0.517) con 9 alelos, esto puede deberse a que la Ho en ambos marcadores es menor con respecto a la Ho de los demás loci microsatélite. En el Cuadro 9 se muestra los valores del contenido de información polimórfica para cada marcador. Cuadro 9. Contenido de Información Polimórfica de las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara. Locus Ch'aku Ccara Total GLM4 0.745 0.752 0.753 LAB1 0.766 0.708 0.735 LCA54 0.531 0.497 0.517 LCA65 0.584 0.591 0.59 LCA77 0.594 0.63 0.62 LCA82 0.751 0.663 0.705 LCA83 0.738 0.704 0.728 LCA85 0.825 0.776 0.8 LGU76 0.821 0.766 0.791 YWLL08 0.902 0.857 0.883 YWLL44 0.863 0.856 0.863 YWLL59 0.823 0.814 0.819 VOLP03 0.623 0.572 0.593 MEDIA 0.736 0.707 0.723 64 Los valores de PIC de los 13 marcadores microsatélite son similares a los observados en estudios reportados con llamas (Penedo et al., 1998, Bustamante, 2002, 2006; Barreta et al., 2012). En todos estos trabajos, al igual que en el presente estudio, tuvieron un valor de PIC elevado. 4.1.4 EQUILIBRIO HARDY-WEINBERG a. GLOBAL En el Cuadro 10 se muestra el análisis por marcador del equilibrio Hardy-Weinberg (HW) global, es decir de ambas poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara que conforman la población total de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata. De los 13 marcadores microsatélites, cinco están en equilibrio HW (P>0.05): LCA77, LGU76, YWLL08, YWLL44 y VOLP03. Los otros loci mostraron desvíos significativos del equilibrio HW (P < 0,05). El test multi-locus de HW realizado para la población global de llamas, también sugirió que la población entera de llamas estudiada estaba en desequilibrio Hardy-Weinberg. Todas las desviaciones del equilibrio HW estuvieron explicadas por deficiencia de heterocigosidad de acuerdo al programa Genepop 4.0.11. El exceso de individuos homocigotos en una población doméstica puede evidenciar el efecto de la selección artificial practicada mediante el manejo reproductivo. 65 Cuadro 10. Análisis de la desviación del Equilibrio Hardy-Weinberg global por marcador. Déficit de Exceso de Desviación Locus Heterocigotos Heterocigotos Estándar (P-value) (P-value) GLM4 0.0062 0.9904 0 LAB1 0 1 0 LCA54 0.0217 0.9779 0.0051 LCA65 0.054 0.8672 0.0134 LCA77 0.259 0.7157 0.015 LCA82 0.0001 0.9999 0 LCA83 0.0463 0.9663 0.0066 LCA85 0.0002 0.9997 0.0001 LGU76 0.139 0.8151 0.0227 YWLL08 0.182 0.8269 0.0458 YWLL44 0.118 0.8714 0 YWLL59 0 1 0 VOLP03 0.434 0.5906 0.0511 b. POR POBLACIÓN Para el análisis de la existencia del equilibrio HW de cada marcador por población se usó el programa Genepop 4.0.11, mediante el test para exceso de heterocigotos, y el test para déficit de heterocigotos. La prueba del equilibrio HW demostró que en general los loci estuvieron en desequilibrio debido a un déficit de heterocigotos (FIS >0), con excepción de LCA77, LCA83 y VOLP03, en la población de llamas Ch’aku, donde se observó exceso de heterocigotos (FIS <0) (Cuadro 11). El exceso de homocigotos indica una clara pérdida de variabilidad y a su vez, evidencia la ausencia de apareamientos al azar en ambas poblaciones. Diversos trabajos de caracterización de camélidos sudamericanos realizados con diferentes microsatélites (Sarno et al., 2001, Wheeler et al., 2004, Maté et al., 2005), detectaron también un marcado déficit de heterocigotos en la población de camélidos sudamericanos. 66 Si la proporción de genotipos para un solo locus no está en equilibrio HW, se puede atribuir a que ha habido selección que ha afectado dicho locus o a la existencia de alelos nulos, pero si son varios loci independientes los que se desvían significativamente del equilibrio HW, este fenómeno puede deberse a que dentro de la población existen subdivisiones: efecto Wahlund (lo cual más adelante mostramos que no ocurre debido a que la diferenciación genética entre ambas poblaciones es muy baja), a que existe migración o flujo de genes o también al manejo mediante la práctica de apareamientos dirigidos por el criador (selección artificial) (Darío, 2007); sumado a esto, está a la misma historia evolutiva de las llamas, ya que su comportamiento reproductivo natural es la poligínico, donde los rebaños están conformados por machos, hembras y sus crías, estableciéndose jerarquías sociales con un macho dominante que controla el acceso de otros machos a su territorio de reproducción, alimento y bebida. Además, el macho dominante expulsa a las crías macho antes de que cumplan un año de edad y retiene a las hembras para asegurar el crecimiento del rebaño (Franklin, 1992). Este comportamiento de exclusión de machos jóvenes e inclusión de hembras, que es conservado en las poblaciones bajo manejo resultaría en un déficit de heterocigotos. Por otra parte, no se puede excluir la existencia probable de alelos nulos (Bustamante et al., 2006) por lo que su análisis se presenta a continuación. Además, como en otros estudios poblacionales de vicuñas y guanacos (Sarno et al., 2001; Maté et al., 2005; Vallejo et al., 2008) y llamas y alpacas (Bustamante et al., 2002, 2006; La Manna et al., 2011; Barreta et al., 2012) se observaron desvíos significativos del equilibrio de H-W, debido a un exceso de homocigotos. Entre las causales de estos desvíos podrían mencionarse a la práctica de apareamientos dirigidos por el criador (selección artificial), a una subdivisión poblacional o bien a la existencia de alelos nulos 67 Cuadro 11. Análisis de la desviación del equilibrio HW por marcador y por población, por medio de la FIS de Weir y Cockerhan y Robertson y Hill (1984). Score Test 5000 iteraciones. POBLACIÓN CH'AKU CCARA Déficit de Exceso de FIS Déficit de Exceso de FIS FIS (Weir y FIS (Weir y Locus Heterocigotos Heterocigotos (Robertson Heterocigotos Heterocigotos (Robertson Cockerhan) Cockerhan) (P-value) (P-value) y Hill) (P-value) (P-value) y Hill) GLM4 0.0043 0.9997 0.145 0.145 0.2332 0.7476 0.0335 0.0126 LAB1 0 0.9595 0.087 0.2396 0.1997 0.7765 0.0435 0.018 LCA54 0.4336 0.578 0.0049 0.0026 0.4318 0.599 0.035 0.001 LCA65 0.3251 0.7623 0.0676 0.0139 0.1958 0.8105 0.0518 0.0197 LCA77 0.7613 0.3991 -0.0216 -0.0133 0.2567 0.7405 0.0171 0.0117 LCA82 0.0084 0.9866 0.1327 0.1041 0.001 0.9976 0.2788 0.1581 LCA83 0.023 0.9656 -0.0152 -0.0814 0.2985 0.7576 0.0251 0.016 LCA85 0.0036 0.9963 0.1063 0.112 0.0172 0.9852 0.0788 0.0759 LGU76 0.0955 0.9229 0.0388 0.0376 0.2207 0.7914 0.0536 0.0116 YWLL08 0.0032 1 0.1439 0.0734 0.0151 0.9903 0.0756 0.0354 YWLL44 0.0587 0.9562 0.0694 0.0491 0.1947 0.7281 0.0373 0.01 YWLL59 0 1 0.1348 0.1615 0.0256 0.9774 0.1227 0.0431 VOLP03 0.9264 0.0607 -0.0785 -0.0338 0.2005 0.846 0.0905 0.0195 68 4.1.5 ALELOS NULOS Debido a que se observó un déficit de heterocigotos (He>Ho) en todos los loci y por ende un desequilibrio de Hardy-Weinberg, es necesario evaluar si esto esta explicado por la presencia de alelos nulos que ocasionan la no detección de ciertos alelos heterocigotos resultando en una sobreestimación del nivel de homocigosidad. El Cuadro 12 muestra la frecuencia de alelos nulos de cada locus calculada mediante el programa Cervus 3.0.3, se observa que las frecuencias estimadas de alelos nulos en cada locus es cercana a cero por lo cual se puede considerar como nula (Fendri, 2008). Es decir que el número de homocigotos detectado en cada locus es muy cercano al que existe realmente y no afectan en los resultados obtenidos ni a las conclusiones de este trabajo. Además, este análisis permite descartar a los alelos nulos como una de las causas principales de la desviación del equilibrio HW. Por lo que probablemente el desequilibrio Hardy- Weinberg se deba principalmente al efecto de la selección artificial por medio del manejo de los criadores. Cuadro 12. Frecuencia de alelos nulos por locus. Locus F0 GLM4 0.035 LAB1 0.029 LCA54 0.028 LCA65 0.031 LCA77 0.003 LCA82 0.033 LCA83 0.009 LCA85 0.046 LGU76 0.022 YWLL08 0.020 YWLL44 0.016 YWLL59 0.062 VOLP03 0.016 69 4.1.6 DIVERSIDAD GENÉTICA La diversidad genética de los 13 marcadores microsatélites analizados para cada población de llamas, fue calculada mediante el programa Fstat 2.9.3.2. La figura 22, muestra que todos los marcadores presentan una alta diversidad genética y esta fue mayor en la población de llamas Ch’aku (0.772) que en las llamas Ccara (0.744), mientras que la diversidad genética total fue de 0.758. La diversidad genética máxima en la población de llamas Ch’aku corresponde a los locus YWLL08 (0.902), YWLL44 (0.878), LCA85 (0.849) YWLL59 (0.844), al igual que en la población de llamas Ccara: YWLL08 (0.871), YWLL44 (0.870), YWLL59 (0.836) y LCA85 (0.805). La diversidad genética más baja correspondió al locus LCA54: 0.613 y 0.557, para la población de llamas Ch’aku y Ccara respectivamente. A la vista de los resultados de He, Ho y de PIC obtenidos para estos microsatélites se puede afirmar que los marcadores para la población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata presentan alta diversidad genética; sin embargo, no es información suficiente para afirmar que este Banco representa la máxima variabilidad genética presente en las poblaciones de llamas de los departamentos de Cuzco y Puno, por lo que el PNI de Recursos Genéticos Animales del INIA, está llevando a cabo investigaciones enfocadas en la identifi- cación y búsqueda de nuevas poblaciones de llamas que posean variabilidades genéticas altas y que puedan servir como vías para enriquecer la diversidad del banco de germoplasma, convirtiéndolo en una población con alta diversidad que cumpla su papel principal de conservación y resguardo de genes promisorios para el mejoramiento genético y adaptabilidad hacia el futuro cambio ambiental (Revista Agroinnova, 2011). 70 Figura 22. Diversidad genética por locus y por población. 4.2 DIFERENCIACIÓN GENÉTICA ENTRE LAS LLAMAS CH’AKU Y CCARA Para poder obtener datos con respecto a la diferenciación genética de las poblaciones, se utilizó el programa Genepop 3.0.3. Los resultados se presentan en el Cuadro 13 (las probabilidades corresponden a la probabilidad estadística comparable con α de 0.05 de poder utilizar para diferenciar los pares de poblaciones en ese microsatélite). La diferenciación genética global para cada uno de los marcadores no muestra valores significativos, lo cual indica que los marcadores utilizados no son robustos al momento de diferenciar las dos poblaciones de llamas del Banco de Quimsachata. Este resultado concuerda con el resultado obtenido del software Geneclass, el cual asigna a los individuos en grupos en base a su perfil genético. Se observó que el programa asignó a todos los individuos en un solo grupo, es decir la población de llamas Ch’aku y la población de llamas Ccara fue reconocida como una misma población. 71 Cuadro 13. Diferenciación genética entre las poblaciones de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata. Locus Probabilidad Desviación estándar GLM4 0.208 0.0086 LAB1 0.024 0.0041 LCA54 0.003 0 LCA65 0.002 0.01 LCA77 0.045 0.0097 LCA82 0.003 0 LCA83 0.131 0 LCA85 0.116 0.00058 LGU76 0.236 0.0039 YWLL08 0.003 0 YWLL44 0.006 0 YWLL59 0.046 0.0084 VOLP03 0.001 0.003 4.2.1 ESTADÍSTICOS F DE WRIGHT En el Cuadro 14 se muestra los estadísticos F de Wright promedio obtenidos con cada uno de los 13 microsatélites, calculados mediante el programa Fstat 2.9.3.2., Goudet (2002) y tomando a las dos poblaciones de llamas como un todo. Para ello se empleo el procedimiento de Weir y Cockerham (1984) para cada locus por medio de la estimación de la FIT, FST y FIS. El parámetro FIS indica el porcentaje promedio de desequilibrio entre las poblaciones. El valor de FST indica el grado de diferenciación entre las poblaciones de llamas, es decir, que parte de la variabilidad genética total se debe a las diferencias genéticas entre las poblaciones. Por último el parámetro FIT nos indica el porcentaje de déficit medio de heterocigotos o porcentaje de exceso de homocigotos respecto al equilibrio HW. 72 Cuadro 14. Estadísticos F para todos los loci de la población total de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata Locus FIT FST FIS GLM4 0.078 0.005 0.073 LAB1 0.065 0.009 0.056 LCA54 0.071 0.033 0.04 LCA65 0.056 0.001 0.054 LCA77 0.009 0.005 0.004 LCA82 0.236 0.017 0.223 LCA83 0.032 0.022 0.01 LCA85 0.097 0.009 0.089 LGU76 0.048 0.009 0.039 YWLL08 0.049 0.016 0.034 YWLL44 0.038 0.005 0.033 YWLL59 0.118 0.001 0.118 VOLP03 0.029 0.002 0.027 El análisis del Cuadro 14 demuestra lo siguiente.  El marcador GLM4 tiene un 7.8 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW; la diferenciación genética entre las poblaciones es de 0.4 por ciento y además el desequilibrio dentro de las poblaciones fue de 7.3 por ciento a favor de los homocigotos.  El marcador LAB1 tiene un 6.5 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW. La diferenciación genética entre las población para este locus fue de 0.9 por ciento y tuvo un 5.6 por ciento de desequilibrio dentro de las poblaciones a favor de los homocigotos.  El marcador LCA54 presenta un 7.1 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW. La diferenciación genética entre las poblaciones fue de 3.3 73 por ciento; y hay un 4 por ciento de desequilibrio dentro de las poblaciones a favor de los homocigotos.  El marcador LCA65 presenta un 5.6 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW. La diferenciación genética entre ambas poblaciones fue de 0.1 por ciento, y hay un 5.4 por ciento de desequilibrio dentro de las poblaciones a favor de los homocigotos.  El marcador LCA77 presenta un 0.9 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW. La diferenciación genética entre ambas poblaciones es muy baja: 0.5 por ciento y hay un desequilibrio dentro de las poblaciones a favor de los homocigotos con un valor de 0.4 por ciento  El marcador LCA82 tiene un 23.6 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW, la diferenciación genética fue de 1.7 por ciento y, hay desequilibrio dentro de las poblaciones a favor de los homocigotos (22. 3 por ciento).  El marcador LCA83 posee un 3.2 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW; la diferenciación genética entre las poblaciones fue de 2.2 por ciento y el desequilibrio dentro de las poblaciones tuvo un valor de 1 por ciento a favor de los homocigotos  El marcador LCA85 muestra un 9.7 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW. La diferenciación genética que se encontró entre ambas poblaciones fue de 0.9 por ciento y hay un desequilibrio dentro de las poblaciones a favor de los homocigotos con un valor de 8.9 por ciento.  El marcador LGU76 muestra un 4.8 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW; la diferenciación genética entre las poblaciones es muy baja (0.9 por ciento) y, hay un 3.9 por ciento de desequilibrio dentro de las poblaciones a favor de los homocigotos.  El marcador YWLL08 presenta 4.9 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW. La diferenciación genética entre las poblaciones fue de 1.6 por ciento. El desequilibrio dentro de las poblaciones fue de 3.4 por ciento a favor de los homocigotos.  Para el marcador YWLL44 se tiene un 3.8 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW. La diferenciación genética que se encontró entre las 74 poblaciones fue muy baja de 0.5 por ciento, y mostró un 3.3 por ciento de desequilibrio dentro de las poblaciones a favor de los homocigotos.  El marcador YWLL59 presenta un 11.8 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW. Al igual que el marcador LCA77, su diferenciación genética fue de 0.1 y el desequilibrio dentro de las poblaciones fue de 11.8 por ciento a favor de los homocigotos.  El marcador VOLP03 tiene un 2.9 por ciento más de homocigotos que los que se esperarían en equilibrio HW; la diferenciación genética entre ambas poblaciones de llamas fue de 0.2 por ciento y, el desequilibrio dentro de las poblaciones fue de 2.7 por ciento a favor de los homocigotos. Por lo tanto, los microsatélites LCA82, YWLL59 y LCA85 son los que más contribuyen al déficit de heterocigotos ya que presentan un 23.6, 11.8 y 9.7 por ciento más de homocigotos que lo que se esperaría en equilibrio HW, respectivamente y coincide con los marcadores que presentaron la mayor diferencia entre He y Ho (donde la He>Ho). Tomando el promedio de todos los 13 locus analizados, los resultados indican que en toda la población de llamas del Banco de Germoplasma del INIA hay un 7.2 por ciento más de homocigotos de lo que se esperaría bajo equilibrio HW. El grado de diferenciación genética (FST) calculado para todos los loci y para todas las poblaciones, fue de 0.01; lo cual según Wright (1978), es un valor muy bajo, siendo un indicativo de poca diferenciación genética entre las poblaciones de llamas estudiadas. El valor medio de FIS fue de 0.063 indicando desequilibrio a favor de los homocigotos, reflejando el efecto que tiene la selección artificial con los sistemas de manejo y prácticas de apareamiento dirigido (Cuadro 15). Cuadro 15. Estadísticos F global de la población total de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata FIT FST FIS 0.072 0.01 0.063 75 En el Cuadro 16 se observa los valores de FIS para las dos poblaciones de llamas del Banco de Germoplasma del INIA con los 13 microsatélites en conjunto. La población de llamas Ch’aku presenta un valor de FIS similar al de las llamas Ccara. Este índice es una medida indirecta de consanguinidad y concuerda con los resultados obtenidos mediante las pruebas exactas de equilibrio HW. Cuadro 16. Valores de FIS promedio para ambas poblaciones. Población FIS Ch'aku 0.053 Ccara 0.068 4.2.2 ANÁLISIS DE VARIANZA MOLECULAR El análisis de AMOVA, por medio del programa Arlequín 3.1, permitió la partición de la variabilidad genética total entre tres fuentes diferentes de variación: varianza molecular entre individuos, entre poblaciones y dentro de las poblaciones. En el Cuadro 7 se observa que la mayoría de la variación proviene de la variabilidad dentro de las poblaciones (93,95 por ciento), mientras que, solamente el 5.03 por ciento de la variación se debió a la variabilidad en las frecuencias alélicas encontrada entre las poblaciones. El grado de diferenciación genética entre las poblaciones (FST) fue de 0,0102, el cuál coincide con el resultado del programa Fstat 2.9.3.2., Goudet (2002). Este valor según Wright (1978) indica poca diferenciación genética y también una débil estructuración genética entre las 2 poblaciones (Vélez, 2007). Estos resultados son muy semejantes a los valores estimados por Barreta et al., (2012) entre y dentro de los grupos regionales de llamas Bolivianas. Para interpretar estos resultados se debe tomar en cuenta que el Banco de Germoplasma de Quimsachata fue establecido hace 26 años y desde su creación las llamas Ch’aku y Ccara han sido empadradas y manejadas por separado. Este intervalo de tiempo, es improbable para generar diferenciación genética entre los dos fenotipos (La Manna et al., 2011). 76 Cuadro 17. Resultados del análisis de varianza molecular (AMOVA) de las dos poblaciones del Banco de Germoplasma de Quimsachata AMOVA Suma de Componentes Porcentaje de Fuente de Variación GL Cuadrados principales Variación (%) Entre Poblaciones 1 12.845 0.03837 1.02 Entre Individuos entre Poblaciones 249 970.878 0.1886 5.03 Dentro de la Población 251 884 3.52191 93.95 Total 501 1867.723 100 FST : 0.01024 4.2.3 ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA DE LA POBLACIÓN Para analizar la estructura poblacional en los 251 genotipos mediante los 13 marcadores microsatélites, se utilizó el programa STRUCTURE v 2.3 (Pritchard et al., 2000). Con este programa se hace un análisis de agrupamiento de los individuos estudiados en función a su parecido genético, en un diferente número de clusters (K) que representarían el número de poblaciones asumidas utilizando un modelo de mezcla en el cual cada individuo podría contener en su genoma porcentajes variables de las poblaciones ancestrales de las que proviene (Estévez, 2009). Cuando la barra vertical es de un solo color significa que el 100 % del genoma de ese individuo pertenece a ese cluster (K), mientras que si tiene dos o más colores significa que comparte el genoma con otros (K) (Darío, 2008). Se realizaron 7 corridas independientes (K= 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) y estas fueron repetidas para corroborar la consistencia de los resultados. La representación grafica fue similar en los 8 clusters y no mostró ninguna evidencia de diferenciación genética o subdivisión poblacional en las poblaciones. En la Figura 23 se puede observar que los individuos de ambos fenotipos fueron asignados a dos clusters (cada uno de color distinto: rojo y verde) y no hay una clara separación entre las dos poblaciones de llamas del Banco de Quimsachata. Los resultados de los asignamientos de clusters mostraron una débil estructura genética en la población 77 estudiada, ésto fue consistente con el elevado flujo genético entre las poblaciones estudiadas (Barreta et al., 2012). Por lo tanto, la asignación de individuos a clusters, clarificó aún más la baja diferenciación genética entre ambas poblaciones. Figura 23. Análisis de la estructura de las dos poblaciones de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata. 4.3 FLUJO GÉNICO El software estadístico Genepop 3.0.3 fue utilizado para calcular el valor del flujo genético entre las poblaciones estudiadas. Para ello primero se obtiene el número de migrantes (Nm) utilizando los alelos privados. La frecuencia promedio de alelos privados = 0.0107 y un número de migrantes por generación igual 30.9, el cual es un valor elevado, esto se explica porque a pesar que las poblaciones de llamas Ch’aku y Ccara actúan como un sistema cerrado (entre ellas) el Banco de Germoplasma es un sistema semi cerrado en un todo ya que hay el ingreso de llamas Ch’aku y Ccara externas de diversas comunidades de Puno y Cuzco. A este respecto, es importante mencionar que su misma historia de domesticación ha envuelto, a lo largo del tiempo, cruzamientos entre estos dos fenotipos ya sea de manera empírica (por intercambio de reproductores entre los criadores) o incluso accidental entre ellas, lo que ha ocasionado que haya intercambio de material genético. 78 4.4 ANÁLISIS FACTORIAL DE CORRESPONDENCIA El AFC representa la relación genética entre las poblaciones, este fue calculado mediante el programa Genetix 4.0.5utilizando como variable de clasificación los genotipos individuales para los 13 microsatélites. En la figura 24 se puede observar la representación espacial de las poblaciones de llamas: Ch’aku (cuadrados amarillos) y Ccara (cuadrados azules), y lo que podríamos llamar como diferenciación genética entres las poblaciones. Este análisis, permite nuevamente evidenciar claramente la baja diferenciación genética entre las dos poblaciones de llamas estudiadas. Ninguna de las poblaciones se mostró como un grupo independiente con respecto la una de la otra. Figura 24. Representación tridimensional del Análisis Factorial de Correspondencia entre las dos poblaciones de llamas (Amarillo: Ch’aku y Azul: Ccara). 79 V. CONCLUSIONES La población de llamas, Lama glama, Ch'aku y Ccara ubicadas en el Banco de Germoplasma del INIA, simboliza patrimonio natural, económico, cultural e histórico del Perú. Además, constituye, junto con las alpacas, la base del sustento de un vasto sector de la población de la región alto andina de nuestro País. Por estos motivos, es de suma importancia caracterizar la diversidad genética que presenta con el fin de poder protegerla, conservarla y posteriormente utilizarla para impulsar su crianza sostenible. El presente trabajo, provee el primer estudio de diversidad genética en la población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata basado en el análisis de marcadores de tipo microsatélite y presenta las siguientes conclusiones:  Los 13 marcadores microsatélites utilizados son altamente polimórficos e informativos para detectar variabilidad genética en la población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata.  Existe una alta diversidad genética en la población de llamas del Banco de Germoplasma de Quimsachata. Se identificaron un total de 157 alelos en total, altos niveles de heterocigosidad esperada y elevado número promedio de alelos por marcador (12.08). Por lo que el Banco cumple su papel principal de conservación de este recurso animal y puede contribuir aumentar la viabilidad y productividad de las poblaciones de llamas de los departamentos de Puno y Cuzco.  La diferenciación genética entre los fenotipos de llamas Ch’aku y Ccara del Banco de Germoplasma de Quimsachata es muy baja (Fst=0.01). Esta conclusión está apoyada por el valor de flujo génico alto (30.9), y los resultados del análisis factorial de correspondencia (AFC), del análisis de varianza molecular (AMOVA) y del programa STRUCTURE. 80 VI. RECOMENDACIONES  Con el fin de mantener la diversidad genética y evitar el incremento de la consanguinidad en el Banco de Germoplasma de Alpacas de color y Llamas del INIA, es prioritario establecer registros genealógicos que permitan optimizar el diseño de apareamientos entre los individuos (principalmente aquellos con alelos privados).  La diferenciación genética entre los fenotipos de llamas Ch’aku y Ccara debe ser estudiada mediante el análisis de genes relacionados con diferencias fenotípicas observadas, estos podrían identificar variantes alélicas relacionadas a los fenotipos estudiados.  Emplear el panel de microsatélites utilizados en este trabajo para realizar estudios de caracterización molecular en las principales regiones llameras del país: Puno, Cuzco, Huancavelica, Ayacucho, Junín y Arequipa con el fin de identificar diferentes reservorios genéticos que proporcionen nuevos reproductores. Sin embargo hay que tomar en cuenta, que no necesariamente estos marcadores tendrán el mismo comportamiento en otras poblaciones. 81 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Aranguren, J; Jordana, J; y M. Gómez. 2001. Genetic diversity in Spanish donkey breeds using microsatellite DNA markers. Genetics Selection and Evolution 33: 243- 252. 2. Arruda, M; Gonçalves, E; Schneider, M; Da-Silva, A; y M. Versute. 2010. An alternative genotyping method using dye- labeled universal primer to reduce unspecific amplifications. Mol Biol Rep. 37: 2031-2036. 3. Barreta, J; Gutiérrez‐Gil, B; Iñiguez, V; Romero, F; Saavedra, V; Chiri, R; Rodríguez, T; y J. Arranz. 2012. Analysis of genetic diversity in Bolivian llama populations using microsatellites. Journal of Animal Breeding and Genetics. 4. Belkhir, K; Borsa, L; Chikhi, N; y F. Bonhomme. 2003. Genetix: 4.05 logiciel sous windowstm pour la genetique des populations. Laboraoire Genoma Populations, Interactions, Adaptations, Montpellier, France. 5. 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CODIGO ID(N° N° MUESTRA SEXO FENOTIPO COLOR ARETE) LABORATORIO 1 LG-001 166204 H Cc negro 2 LG-002 316306 H Cc cafe oscuro 3 LG-003 406 M Ch cafe 4 LG-004 149206 H Cc gris 5 LG-005 025106 M Cc cafe claro 6 LG-006 031106 M Cc gris manchado 7 LG-007 019105 H Cc blanco manchado 8 LG-008 077106 M Ch gris 9 LG-009 194206 M Cc gris con blanco 10 LG-010 226205 H Cc blanco 11 LG-011 092106 M Ch pibul 12 LG-012 101103 M Ch pibul 13 LG-013 150206 M Cc negro con blanco 14 LG-014 193106 H Cc blanco 15 LG-015 248305 H Cc gris cafe 16 LG-016 139206 M Cc gris 17 LG-017 052105 M Cc cafe claro 18 LG-018 027103 H Cc blanco manchado 19 LG-019 339306 H Cc negro manchado cafe oscuro con 20 LG-020 285206 M Cc blanco 21 LG-021 140206 M Cc cafe oscuro 22 LG-022 136206 M Cc pibul 23 LG-023 148206 M Cc cafe claro 24 LG-024 022104 H Cc cafe 91 25 LG-025 197203 H Cc negro cafe oscuro con 26 LG-026 285206 M Cc blanco 27 LG-027 072101 H Cc pibul 28 LG-028 820200 H Cc pibul 29 LG-029 145206 M Ch cafe claro 30 LG-030 244305 H Cc cafe blanco 31 LG-031 067106 M Cc cafe 32 LG-032 068106 M Cc blanco 33 LG-033 308306 M Cc blanco 34 LG-034 057106 H Cc blanco manchado 35 LG-035 065204 H Cc cafe claro 36 LG-036 191206 M Ch APU 37 LG-037 017106 H Cc gris manchado 38 LG-038 217305 H Ch 39 LG-039 277206 H Cc pibul 257 LG-040 295409 H Cc pibul 41 LG-041 360306 H Cc cafe 42 LG-042 154206 M Cc cafe claro 256 LG-043 288409 H Cc café 44 LG-044 301306 H Cc pibul cafe oscuro con 45 LG-045 284206 M Cc blanco 255 LG-046 282409 H Cc LF 47 LG-047 239203 H Cc 48 LG-048 013105 H Cc blanco 49 LG-049 068103 H Cc gris 50 LG-050 32306 M Ch 54 LG-051 028104 H Ch blanco 55 LG-052 041104 M Cc café 56 LG-053 089204 M Ch blanco 57 LG-054 158204 H Ch café 58 LG-055 161204 M Ch café 59 LG-056 031205 H Ch 60 LG-057 040105 M Ch pibul 61 LG-058 043105 H Ch café claro 62 LG-059 061105 H Ch blanco 63 LG-060 077105 H Cc café 64 LG-061 098205 H Ch gris 65 LG-062 104205 H Ch blanco 66 LG-063 127205 H Cc cafe claro 67 LG-064 131205 M Ch gris 92 68 LG-065 177205 H Cc pibul 69 LG-066 233305 H Cc pibul 70 LG-067 240305 H Cc café claro 71 LG-068 270305 H Cc blanco 72 LG-069 0206 M Ch cafe con blanco 73 LG-070 0506 M Cc cafe oscuro 74 LG-071 606 M Cc gris 75 LG-072 806 M Cc cafe 76 LG-073 001106 M Cc café 77 LG-074 017106 M Ch pibul 78 LG-075 041106 H Cc blanco 79 LG-076 055106 H Cc blanco 80 LG-077 063106 H Cc café oscuro 81 LG-078 069106 M Ch negro 82 LG-079 076106 M Cc café con gris 83 LG-080 077106 M Ch gris 84 LG-081 080106 M Cc café 85 LG-082 099106 M Cc blanco con gris 86 LG-083 114206 M Cc café claro 87 LG-084 120206 H Ch blanco 88 LG-085 121206 H Cc café claro 89 LG-086 145206 M Ch café claro 90 LG-087 184206 H Cc negro con blanco 259 LG-088 303409 H Cc café 92 LG-089 196206 H Ch gris 93 LG-090 207206 H Ch café oscuro 94 LG-091 213206 M Ch café con blanco 95 LG-092 215206 M Cc blanco 96 LG-093 227206 H Cc pibul 97 LG-094 230206 H Cc blanco 98 LG-095 233206 M Cc café 99 LG-096 234206 H Cc café con gris 100 LG-097 237206 H Cc blanco 101 LG-098 239206 M Cc blanco 102 LG-099 242206 H Cc pibul 103 LG-100 258206 M Cc pibul 104 LG-101 264206 H Cc café 105 LG-102 279206 H Ch pibul 106 LG-103 280206 H Ch café 107 LG-104 289206 M Cc blanco 108 LG-105 309306 H Ch café claro 93 109 LG-106 350306 H Cc café 110 LG-107 015107 M Cc blanco 111 LG-108 024107 M Cc café 112 LG-109 036107 H Cc blanco 113 LG-110 057207 H Ch café oscuro 114 LG-111 066207 H Ch pibul 115 LG-112 071207 M Ch blanco 116 LG-113 091207 H Cc café 117 LG-114 101207 H Cc negro 118 LG-115 123207 H Ch café 119 LG-116 125207 H Cc blanco 120 LG-117 153207 H Ch gris 121 LG-118 193207 H Cc pibul 122 LG-119 234307 H Cc café rojizo 123 LG-120 247307 H Ch café claro 124 LG-121 296407 H Ch pibul 125 LG-122 011108 H Ch café oscuro 126 LG-123 016108 H Cc gris 127 LG-124 020108 M Cc café 128 LG-125 021108 H Cc blanco 129 LG-126 025108 H Cc café claro 130 LG-127 044108 H Cc café 131 LG-128 048108 M Cc gris 132 LG-129 053108 M Cc gris 133 LG-130 054108 H Ch blanco 134 LG-131 060108 H Cc gris 135 LG-132 068108 M Ch gris 136 LG-133 070108 H Cc blanco pibul cara con 137 LG-134 072208 H Ch manchas 138 LG-135 076208 M Cc gris 139 LG-136 082208 H Ch pibul 140 LG-137 087208 H Ch café oscuro 141 LG-138 092208 M Cc gris 142 LG-139 110208 H Cc café 143 LG-140 111208 H Cc café 144 LG-141 120208 M Cc café 145 LG-142 121208 H Ch café 146 LG-143 125208 H Ch negro 147 LG-144 127208 M Cc blanco blanco cara 148 LG-145 131208 H Ch manchada 94 149 LG-146 134208 H Cc blanco 150 LG-147 155208 H Ch café claro 151 LG-148 161208 M Cc café 152 LG-149 170308 H Cc blanco 153 LG-150 173308 H Cc café oscuro 154 LG-151 198308 H Ch café 155 LG-152 199308 H Cc café claro 156 LG-153 201308 H Cc blanco 157 LG-154 208308 H Ch café 158 LG-155 217308 H Ch LF 159 LG-156 222308 M Cc gris 160 LG-157 230308 H Ch blanco 161 LG-158 234308 H Ch blanco 162 LG-159 236308 H Ch café oscuro 163 LG-160 243308 H Ch café blanco 164 LG-161 244308 H Cc negro 165 LG-162 248308 H Ch café blanco 166 LG-163 255408 M Cc blanco 167 LG-164 001109 H Cc café blanco 168 LG-165 002109 M Cc pibul 169 LG-166 003109 H Ch café blanco 170 LG-167 007109 M Ch café 258 LG-168 296409 H Cc café claro 172 LG-169 012109 M Cc pibul 173 LG-170 015109 H Cc gris 174 LG-171 020109 H Cc café 175 LG-172 021109 M Cc gris 176 LG-173 023109 H Ch café 177 LG-174 029109 M Cc café 178 LG-175 042109 H Ch café 179 LG-176 044109 M Ch negro 180 LG-177 045109 M Ch café 181 LG-178 047109 H Ch café gris 182 LG-179 052109 H Ch pibul 183 LG-180 057209 H Cc café 184 LG-181 059209 M Cc gris 185 LG-182 061209 H Cc café oscuro 186 LG-183 066209 H Ch pibul 187 LG-184 070209 H Cc café claro 188 LG-185 072209 H Cc café con blanco 95 189 LG-186 073209 H Cc café con blanco 190 LG-187 075209 H Cc café 191 LG-188 080209 H Cc blanco 192 LG-189 086209 H Cc café manchado 193 LG-190 092209 H Cc pibul 194 LG-191 095209 H Cc pibul 195 LG-192 104209 H Cc pibul 196 LG-193 106209 H Ch pibul 197 LG-194 107209 H Cc café manchado 198 LG-195 110209 H Cc blanco 199 LG-196 119209 H Cc blanco manchado 200 LG-197 120209 H Cc café gris 201 LG-198 122209 M Ch LF 202 LG-199 129209 H Ch café 203 LG-200 131209 M Cc café 204 LG-201 132209 H Ch pibul 205 LG-202 136209 H Ch café claro 206 LG-203 137209 H Ch café oscuro 207 LG-204 138209 H Cc blanco-pivul 208 LG-205 140209 H Cc café blanco 209 LG-206 146209 H Ch café oscuro 210 LG-207 150209 H Cc café 211 LG-208 155209 H Cc blanco 212 LG-209 156209 H Cc café blanco 213 LG-210 157209 H Ch pibul 214 LG-211 158209 M Ch café 215 LG-212 161209 H Cc gris 216 LG-213 165309 H Cc café 217 LG-214 166309 M Cc gris 218 LG-215 167309 H Cc café 219 LG-216 170309 H Ch café claro 220 LG-217 175309 H Ch café blanco 221 LG-218 176309 H Ch café 222 LG-219 181309 H Cc café oscuro 223 LG-220 183309 H Ch café oscuro 224 LG-221 187309 H Ch café blanco 225 LG-222 189309 H Cc café 226 LG-223 190309 H Ch café oscuro 227 LG-224 192309 H Ch café blanco 228 LG-225 194309 H Cc café 229 LG-226 195309 H Cc blanco 96 230 LG-227 199309 H Cc café gris 231 LG-228 200309 H Cc café oscuro 232 LG-229 204309 M Cc café 233 LG-230 205309 H Ch café 234 LG-231 207309 H Cc café claro 235 LG-232 217309 H Cc gris 236 LG-233 222309 H Cc LF 237 LG-234 224309 H Cc blanco 238 LG-235 225309 H Cc gris 239 LG-236 227309 H Ch café 240 LG-237 232309 H Cc negro con blanco 241 LG-238 234309 H Cc blanco 242 LG-239 235309 M Ch café 243 LG-240 238309 H Ch blanco 244 LG-241 239309 H Cc blanco 245 LG-242 245309 H Ch blanco 246 LG-243 246309 H Ch café 247 LG-244 260409 H Cc café 248 LG-245 261409 H Ch café con blanco 249 LG-246 269409 H Ch pibul 250 LG-247 270409 H Ch café 251 LG-248 273409 H Ch café 252 LG-249 275409 H Cc negro con blanco 253 LG-250 279409 H Ch café claro 254 LG-251 281409 H Cc café 97 ANEXO II. Concentración y Calidad del ADN Stock. Volumen Nucleic Acid [ ] Volumen ADN AGUA ADN # MUESTRA 260/280 260/230 Inicial Conc. (ng/µl) FINAL Final (µL) (µL) restante 1 LG-002A 50 46.8 25 100 53.42 46.58 1.76 1.95 3.42 2 LG-002B 50 15.8 25 100 158.23 58.23 2.02 1.65 108.23 3 LG-003A 50 178.9 25 200 27.95 172.05 1.83 1.47 22.05 4 LG-003B 50 189.3 25 200 26.41 173.59 1.81 1.48 23.59 5 LG-004A 50 97.8 25 100 25.56 74.44 1.79 2.18 24.44 6 LG-004B 50 23.4 25 100 106.84 -6.84 1.66 1.35 -56.84 7 LG-005A 50 62.9 25 100 39.75 60.25 1.72 1.61 10.25 8 LG-005B 50 35.9 25 100 69.64 30.36 1.51 1.04 -19.64 9 LG-006A 50 66.3 25 100 37.71 62.29 1.83 2.04 12.29 10 LG-006B 50 20.7 25 100 120.77 20.77 1.68 1.71 70.77 11 LG-008A 50 153.4 25 200 32.59 167.41 1.87 1.49 17.41 12 LG-008B 50 146.4 25 200 34.15 165.85 1.89 1.51 15.85 13 LG-010A 50 86.6 25 100 28.87 71.13 1.8 2.35 21.13 14 LG-010B 50 21.1 25 100 118.48 18.48 1.89 1.99 68.48 15 LG-011A 50 149.7 25 200 33.40 166.60 1.92 1.51 16.60 16 LG-011B 50 123.4 25 100 20.26 79.74 1.94 1.44 29.74 17 LG-012A 50 968.6 25 200 5.16 194.84 1.65 1.92 44.84 18 LG-012B 50 376.2 25 200 13.29 186.71 1.56 1.67 36.71 19 LG-014A 50 53.4 25 100 46.82 53.18 1.76 2.03 3.18 20 LG-014B 50 17.8 25 100 140.45 -40.45 1.76 1.59 -90.45 21 LG-016A 50 45.5 25 100 54.95 45.05 1.76 1.89 -4.95 22 LG-016B 50 18 25 100 138.89 38.89 1.74 1.62 88.89 23 LG-017A 50 71.7 25 100 34.87 65.13 1.7 1.45 15.13 98 24 LG-017B 50 17.3 25 100 144.51 44.51 1.76 1.59 94.51 25 LG-021A 50 503 25 200 9.94 190.06 1.29 1.6 40.06 26 LG-021B 50 561.1 25 200 8.91 191.09 1.86 2.02 41.09 27 LG-029A 50 84.4 25 100 29.62 70.38 1.95 1.35 20.38 28 LG-029B 50 96.2 25 100 25.99 74.01 1.94 1.33 24.01 29 LG-036A 50 245.6 25 200 20.36 179.64 1.81 1.67 29.64 30 LG-036B 50 233.4 25 200 21.42 178.58 1.82 1.65 28.58 31 LG-051A 80 99.8 25 100 25.05 74.95 1.87 1.51 54.95 32 LG-051B 80 62.7 25 100 39.87 60.13 1.91 1.23 40.13 33 LG-052A 80 94.1 25 100 26.57 73.43 1.89 1.45 53.43 34 LG-052B 50 164.9 25 100 15.16 84.84 1.82 1.7 34.84 35 LG-053A 50 65.9 25 100 37.94 62.06 1.91 1.22 12.06 36 LG-053B 50 130.3 25 100 19.19 80.81 1.85 1.55 30.81 37 LG-054A 30 24.1 25 100 103.73 3.73 2 0.56 73.73 38 LG-054B 30 14.8 25 100 168.92 68.29 1.98 0.4 -138.92 39 LG-055A 30 -0.4 25 100 62.50 37.50 1.8 1.82 32.50 40 LG-055B 30 5.6 25 100 446.43 346.36 2.65 0.19 416.63 41 LG-056A 30 16.7 25 100 149.70 -49.70 1.98 0.49 119.70 42 LG-056B 30 34.5 25 100 72.46 27.54 1.94 0.83 42.46 43 LG-057A 30 11.8 25 100 211.86 111.86 1.97 0.38 181.86 44 LG-057B 30 154.2 25 100 16.21 83.79 1.81 1.64 13.79 45 LG-058A 30 5 25 100 500.00 400.00 2.17 0.16 470.00 46 LG-058B 30 11.4 25 100 219.30 119.30 2.01 0.35 189.30 47 LG-059A 30 2 25 100 125.00 11.50 1.98 1.71 95.00 48 LG-059B 30 0.6 25 100 41.66 40.66 1.97 0.02 -11.66 49 LG-060A 30 31.5 25 100 79.37 20.63 1.94 0.96 -49.37 50 LG-060B 30 27.7 25 100 90.25 9.75 2 0.76 60.25 51 LG-061A 50 127 25 100 19.69 80.31 1.85 1.59 30.31 99 52 LG-061B 30 184 25 100 13.59 86.41 1.79 1.71 16.41 53 LG-062A 80 105 25 100 23.81 76.19 1.87 1.5 56.19 54 LG-062B 50 155.9 25 100 16.04 83.96 1.82 1.68 33.96 55 LG-063A 30 54.4 25 100 45.96 54.04 1.93 1.04 15.96 56 LG-063B 30 82.4 25 100 30.34 69.66 1.84 1.29 -0.34 57 LG-064A 30 24.1 25 100 103.73 -3.73 2.05 0.57 -73.73 58 LG-064B 30 55.5 25 100 45.05 54.95 1.93 1.06 -15.05 59 LG-065A 50 129.9 25 100 19.25 80.75 1.86 1.57 30.75 60 LG-065B 50 269.3 25 100 9.28 90.72 1.71 1.76 40.72 61 LG-066A 50 118.1 25 100 21.17 78.83 1.85 1.59 28.83 62 LG-066B 50 113.7 25 100 21.99 78.01 1.86 1.5 28.01 63 LG-067A 50 81.7 25 100 30.60 69.40 1.92 1.37 19.40 64 LG-067B 30 57.3 25 100 43.63 56.37 1.89 1.77 -13.63 65 LG-068A 50 188.3 25 100 13.28 86.72 1.78 1.69 36.72 66 LG-068B 50 242.7 25 100 10.30 89.70 1.71 1.93 39.70 67 LG-069A 30 7.9 25 100 316.46 -216.46 10.56 0.41 -286.46 68 LG-069B 30 25 25 100 100.00 0.00 2.4 1 -70.00 69 LG-070A 30 21.6 25 100 115.74 -15.74 1.85 0.68 -85.74 70 LG-070B 30 2.9 25 100 862.07 -762.07 -2.62 0.29 -832.07 71 LG-070B 30 2.3 25 100 1086.96 -986.96 -3.3 0.25 -1056.96 72 LG-071A 50 83.3 25 100 30.01 69.99 1.95 1.78 19.99 73 LG-071B 50 102.5 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123.6 25 100 20.23 79.77 1.83 1.51 29.77 359 LG-218B 50 112.7 25 100 22.18 77.82 1.86 1.53 27.82 110 360 LG-219A 50 131.2 25 100 19.05 80.95 1.83 1.7 30.95 361 LG-219B 50 142.6 25 100 17.53 82.47 1.83 1.54 32.47 362 LG-220A 50 344.5 25 100 7.26 92.74 1.53 1.64 42.74 363 LG-220B 50 387.8 25 100 6.45 93.55 1.38 1.57 43.55 364 LG-221A 50 185.7 25 100 13.46 86.54 1.2 0.9 36.54 365 LG-221B 50 44.4 25 100 56.31 43.69 1.9 0.99 -6.31 366 LG-222A 50 193 25 100 12.95 87.05 1.77 1.73 37.05 367 LG-222B 50 597.4 25 100 4.18 95.82 1.77 1.94 45.82 368 LG-223A 50 244.8 25 100 10.21 89.79 1.69 1.73 39.79 369 LG-223B 50 262.2 25 100 9.53 90.47 1.68 1.68 40.47 370 LG-224A 50 179.7 25 100 13.91 86.09 1.76 1.61 36.09 371 LG-224B 30 1082.6 25 100 2.31 97.69 1.57 1.86 27.69 372 LG-225A 50 18.4 25 100 135.87 -35.87 2.35 0.57 -85.87 373 LG-225B 30 40 25 100 62.50 37.50 2.03 0.89 -32.50 374 LG-226A 50 229.9 25 100 10.87 89.13 1.73 1.8 39.13 375 LG-226B 50 251.1 25 100 9.96 90.04 1.68 1.8 40.04 376 LG-227A 50 283 25 100 8.83 91.17 1.66 1.76 41.17 377 LG-227B 50 241.7 25 100 10.34 89.66 1.72 1.78 39.66 378 LG-228A 50 229.4 25 100 10.90 89.10 1.71 1.76 39.10 379 LG-228B 80 204.4 25 100 12.23 87.77 1.76 1.77 67.77 380 LG-229A 50 344.8 25 100 7.25 92.75 1.52 1.43 42.75 381 LG-229B 80 138.9 25 100 18.00 82.00 1.81 1.6 62.00 382 LG-230A 50 266 25 100 9.40 90.60 1.66 1.74 40.60 383 LG-230B 50 281.5 25 100 8.88 91.12 1.66 1.71 41.12 384 LG-231A 50 288.9 25 100 8.65 91.35 1.65 1.81 41.35 385 LG-231B 50 275.8 25 100 9.06 90.94 1.68 1.8 40.94 386 LG-232A 50 295.2 25 100 8.47 91.53 1.63 1.8 41.53 387 LG-232B 50 270.6 25 100 9.24 90.76 1.62 1.71 40.76 111 388 LG-233A 50 107.6 25 100 23.23 76.77 1.83 1.4 26.77 389 LG-233B 30 49.4 25 100 50.61 49.39 1.81 0.92 -20.61 390 LG-234A 50 256.4 25 100 9.75 90.25 1.68 1.7 40.25 391 LG-234B 50 332.1 25 100 7.53 92.47 1.55 1.72 42.47 392 LG-235A 30 272.6 25 100 9.17 90.83 1.62 1.66 20.83 393 LG-235B 30 683 25 100 3.66 96.34 1.73 1.68 26.34 394 LG-236A 50 755.3 25 100 3.31 96.69 1.67 1.75 46.69 395 LG-236B 50 735.8 25 100 3.40 96.60 1.73 1.78 46.60 396 LG-237A 30 5.9 25 100 423.73 -323.73 2.38 0.17 -393.73 397 LG-237B 30 10.5 25 100 238.10 -138.10 1.88 0.26 -208.10 398 LG-238A 50 88 25 100 28.41 71.59 1.88 1.3 21.59 399 LG-238B 30 715.1 25 100 3.50 96.50 1.76 1.92 26.50 400 LG-239A 30 24.3 25 100 102.88 -2.88 2.12 0.63 -72.88 401 LG-239B 30 55 25 100 45.45 54.55 1.91 1.02 -15.45 402 LG-240A 50 257.9 25 100 9.69 90.31 0.98 0.94 40.31 403 LG-240B 50 111.2 25 100 22.48 77.52 1.82 1.35 27.52 404 LG-241A 50 253 25 100 9.88 90.12 1.67 1.68 40.12 405 LG-241B 50 258.4 25 100 9.67 90.33 1.69 1.73 40.33 406 LG-242A 50 189 25 100 13.23 86.77 1.75 1.61 36.77 407 LG-242B 50 192.7 25 100 12.97 87.03 1.75 1.71 37.03 408 LG-243A 50 289.5 25 100 8.64 91.36 1.64 1.79 41.36 409 LG-243B 50 253.8 25 100 9.85 90.15 1.66 1.75 40.15 410 LG-244A 50 86.6 25 100 28.87 71.13 1.57 1.22 21.13 411 LG-244B 50 57.3 25 100 43.63 56.37 1.81 0.96 6.37 412 LG-245A 50 309.1 25 100 8.09 91.91 1.61 1.71 41.91 413 LG-245B 50 300.3 25 100 8.33 91.67 1.6 1.62 41.67 414 LG-246A 50 148.4 25 100 16.85 83.15 1.82 1.51 33.15 415 LG-246B 50 209.9 25 100 11.91 88.09 1.72 1.65 38.09 112 416 LG-247A 50 224 25 100 11.16 88.84 1.74 1.8 38.84 417 LG-247B 50 74.4 25 100 33.60 66.40 1.89 1.25 16.40 418 LG-248A 50 11.8 25 100 211.86 -111.86 2.25 0.39 -161.86 419 LG-248B 50 13.3 25 100 187.97 -87.97 2.27 0.41 -137.97 420 LG-249A 50 169.6 25 100 14.74 85.26 1.78 1.58 35.26 421 LG-249B 50 133.6 25 100 18.71 81.29 1.82 1.63 31.29 422 LG-250A 50 31.4 25 100 79.62 20.38 1.98 0.88 -29.62 423 LG-250B 50 20.6 25 100 121.36 -21.36 2.17 0.58 -71.36 424 LG-251A 50 122 25 100 20.49 79.51 1.8 1.42 29.51 425 LG-251B 50 114.3 25 100 21.87 78.13 1.85 1.5 28.13 426 LG-252A 50 196.8 25 100 12.70 87.30 1.76 1.68 37.30 427 LG-252B 50 207.7 25 100 12.04 87.96 1.75 1.76 37.96 428 LG-253A 50 112.1 25 100 22.30 77.70 1.84 1.52 27.70 429 LG-253B 50 133.8 25 100 18.68 81.32 1.84 1.62 31.32 430 LG-254A 50 166.4 25 100 15.02 84.98 1.79 1.72 34.98 431 LG-254B 50 340 25 100 7.35 92.65 1.48 1.7 42.65 432 LG-255A 50 348.5 25 100 7.17 92.83 1.55 1.78 42.83 433 LG-255B 50 365.2 25 100 6.85 93.15 1.57 1.75 43.15 113 ANEXO III. Concentración y Calidad de Dilución del ADN. CÓDIGO N° MUESTRA 260 280 260/280 ng/µL LABORATORIO 1 LG-001 0.042 0.022 1.957 42.186 2 LG-002 0.025 0.013 1.901 25.367 3 LG-003 4 LG-004 5 LG-005 0.014 0.007 1.914 13.643 6 LG-006 0.016 0.008 1.914 15.736 7 LG-007 0.061 0.032 1.907 60.634 8 LG-008 0.029 0.015 2.007 29.484 9 LG-009 0.012 0.006 1.841 11.849 10 LG-010 0.015 0.008 1.896 14.935 11 LG-011 0.032 0.015 2.054 31.572 12 LG-012 0.042 0.021 2.03 41.744 13 LG-013 0.03 0.015 1.94 29.895 14 LG-014 0.014 0.007 1.929 13.815 15 LG-015 0.011 0.006 1.931 11.49 16 LG-016 0.026 0.013 1.954 26.343 17 LG-017 0.019 0.01 1.935 18.694 18 LG-018 0.006 0.004 1.765 6.373 19 LG-019 0.011 0.006 1.891 10.623 20 LG-020 0.032 0.017 1.89 31.581 21 LG-021 22 LG-022 0.03 0.016 1.89 29.627 23 LG-023 0.013 0.006 1.937 12.589 24 LG-024 0.034 0.018 1.915 34.227 25 LG-025 0.032 0.017 1.874 31.932 26 LG-026 0.03 0.016 1.861 30.031 27 LG-027 0.01 0.006 1.667 9.718 28 LG-028 0.022 0.012 1.946 22.493 29 LG-029 0.031 0.015 2.048 30.537 30 LG-030 0.014 0.007 1.986 14.485 31 LG-031 0.034 0.018 1.877 34.384 32 LG-032 0.025 0.015 1.6 24.928 33 LG-033 34 LG-034 0.017 0.009 1.953 17.216 35 LG-035 0.011 0.005 2.02 10.607 36 LG-036 0.038 0.019 1.994 37.922 37 LG-037 0.025 0.014 1.801 25.026 114 38 LG-038 0.044 0.024 1.871 44.417 39 LG-039 0.035 0.019 1.87 35.023 40 LG-040 0.043 0.023 1.884 43.046 41 LG-041 0.033 0.018 1.891 33.415 42 LG-042 0.017 0.009 1.895 16.629 43 LG-043 0.017 0.009 1.92 17.058 44 LG-044 0.032 0.017 1.887 32.426 45 LG-045 0.016 0.009 1.855 15.889 46 LG-046 0.032 0.017 1.909 32.182 47 LG-047 0.032 0.017 1.926 32.053 48 LG-048 0.016 0.008 1.878 15.759 49 LG-049 0.007 0.003 2.121 7.181 50 LG-050 0.013 0.006 2.049 12.964 51 LG-051 0.028 0.015 1.894 28.25 52 LG-052 0.015 0.008 1.84 14.659 53 LG-053 0.026 0.013 1.939 26.149 54 LG-054 0.02 0.01 1.883 19.764 55 LG-055 0.038 0.02 1.923 37.976 56 LG-056 57 LG-057 0.015 0.008 1.91 15.133 58 LG-058 0.033 0.018 1.885 33.463 59 LG-059 0.027 0.014 1.906 27.068 60 LG-060 0.007 0.004 1.943 6.956 61 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