Rev Inv Vet Perú 2015; 26(4): 614-620 http://dx.doi.org/10.15381/ripep.v26i4.11218 Efecto de Cuatro Diluciones de Plasma Seminal sobre la Tasa de Ovulación, Tamaño de Cuerpo Lúteo y Perfil de Progesterona en Alpacas EFFECT OF FOUR SEMINAL PLASMA DILUTIONS RELATING TO OVULATION RATE, CORPUS LUTEUM SIZE AND PROGESTERONE PROFILE IN ALPACAS Iván Reyna W.1, Wilfredo Huanca L.1,4, Antonio Ampuero B.2, Teodosio Huanca M.3 RESUMEN El estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto de cuatro diluciones de plasma seminal sobre la tasa de ovulación y formación de cuerpo lúteo en alpacas. Se seleccio- naron 44 alpacas sin cría al pie y con la presencia de un folículo dominante >7 mm detectado por ecografía transrectal. Los animales se distribuyeron al azar en cinco gru- pos experimentales: G1, plasma seminal (PS) diluido 1:1 (v/v) con fosfato salino bufferado (PBS); G2, PS diluido 1:2 (v/v) con PBS; G3, PS diluido 1:4 (v/v) con PBS; G4, PS diluido 1:8 (v/v) con PBS; y G5, grupo control con PBS. Se aplicó 1.5 ml de la dilución correspondien- te por vía intramuscular. La tasa de ovulación y el tamaño de cuerpo lúteo fueron evalua- dos al segundo y noveno día, respectivamente (D0= inicio de tratamiento) a través de ecografía transrectal. Muestras de sangre fueron tomadas los días D0, D3, D6, D9 y D12 para determinar niveles séricos de progesterona mediante radioinmunoanálisis. Los re- sultados indicaron una tasa de ovulación del 100% en los grupos tratados con diferentes diluciones de plasma seminal y 0% en el grupo control. El tamaño de cuerpo lúteo y los niveles séricos de progesterona no registraron diferencias estadísticas. Los resultados sugieren que el factor inductor de ovulación presente en el plasma seminal de alpacas tiene un efecto muy potente e induce ovulación aún en dosis bajas. Palabras clave: alpaca, plasma seminal, diluciones, ovulación, factor inductor de ovula- ción ABSTRACT The study was carried out to evaluate the effect of four seminal plasma dilutions on ovulation rate and corpus luteum development in alpacas. Forty four non-lactating alpacas with the presence of a >7 mm dominant follicle detected by transrectal ultrasonography 1 Laboratorio de Reproducción Animal, 2 Laboratorio de Zootecnia y Producción Agropecuaria, Facul- tad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú 3 Estación Experimental ILLPA-INIA, Puno, Perú 4 E-mail: whuanca2002@yahoo.com Recibido: 5 de enero de 2015 Aceptado para publicación: 18 de julio de 2015 614 Efecto de cuatro diluciones de plasma seminal en la ovulación en alpacas were selected. The animals were randomly distributed in five experimental groups: G1 (n=10) seminal plasma (SP) diluted 1:1 (v/v) with phosphate buffered saline (PBS); G2 (n=10) SP diluted 1:2 (v/v) with PBS; G3 (n=10) SP diluted 1:4 (v/v) with PBS; G4 (n=10) SP 1:8 (v/v) with PBS; and G5 (n=4) control group with PBS. A dose of 1.5 ml of the respective solution was intramuscularly administrated. Ovulation rate and corpus luteum size were evaluated at second and ninth day respectively (D0= day of treatment) through ultrasonography. Blood samples were taken on D0, D3, D6, D9 and D12 to determine serum progesterone levels by radioimmunoassay. The results indicated an ovulation rate of 100% in the treated groups and 0% in the control group. The corpus luteum size and serum progesterone levels did not show statistic differences. The results indicated that the ovulation inducing factor present in the seminal plasma has a powerful effect inducing ovulation even at a low dose. Key words: alpaca, seminal plasma, dilutions, ovulation, ovulation inducing factor INTRODUCCIÓN lación del 87% al depositar artificialmente semen del camello en la vagina. Posterior- mente, Pan et al. (2001) lograron aislar y Los camélidos sudamericanos (CSA) purificar el factor inductor de ovulación del forman parte del ambiente físico y cultural plasma seminal en camellos bactrianos. de la región altoandina del Perú, represen- tando una importante actividad económica y Los hallazgos en camellos bactrianos social. Esta región tiene un ambiente poco condujeron a pensar que un factor inductor flexible en términos de uso agropecuario, de de ovulación podría estar presente en el plas- allí que la alpaca y la llama son especies que brindan fibra y una fuente proteica al pobla- ma seminal de los CSA, debido a su relación dor local. filogenética. En el Perú, el primer reporte quesugiere la existencia de un factor inductor de La alpaca se clasifica dentro del grupo ovulación fue realizado por Ríos (1989). Años de ovuladoras inducidas, donde el factor prin- después, López (2004) obtuvo una tasa cipal que desencadena el fenómeno de ovu- ovulatoria del 100% en alpacas luego de ad- lación está dado por la cópula (Fernández ministrar plasma seminal, vía intramuscular. Baca et al., 1972). También puede ser indu- Adams et al. (2005) confirmaron la existen- cida por la administración de hormonas como cia del factor inductor de ovulación presente la gonadotropina coriónica humana (hCG) en el plasma seminal de alpacas y llamas, (San Martín, 1968; Fernández Baca et al., reportando una tasa ovulatoria superior al 1970), hormona liberadora de gonadotropinas 90%, sugiriendo que el plasma seminal esti- (GnRH) y hormona luteinizante (LH) (Bravo mula un incremento en las concentraciones et al., 1992; Sumar, 1997; Leyva y García, de LH. 1999; Huanca et al., 2001). El presente estudio fue realizado con el El primer reporte sobre la existencia de propósito de evaluar el efecto de cuatro dilu- un factor inductor de ovulación en camellos ciones de plasma seminal sobre la tasa de bactrianos fue realizado por Chen et al. ovulación, tamaño de cuerpo lúteo y perfiles (1985), quienes obtuvieron una tasa de ovu- de progesterona en alpacas. Rev Inv Vet Perú 2015; 26(4): 614-620 615 I. Reyna et al. MATERIALES Y MÉTODOS Diseño Experimental Evaluación ecográfica pre-experimental Lugar de Estudio y Animales La evaluación pre-experimental permi- El experimento se desarrolló entre los tió el seguimiento de la actividad ovárica y el meses de enero y marzo, época de lluvias, desarrollo de las ondas foliculares, con el pro- en las instalaciones del Centro de Investiga- pósito de seleccionar animales que presen- ción y Producción (C.I.P) – Quimsachata, ten folículos en fase de crecimiento y con un anexo de la Estación Experimental ILLPA- diámetro igual o mayor de 7 mm. INIA, ubicado a 4200 msnm, en el distrito de Santa Lucía, provincia de Lampa, departa- Determinación de la concentración de pro- mento de Puno. teínas totales en plasma seminal Se seleccionaron 44 alpacas hembras Se determinó la concentración de pro- sin cría al pie, con historial reproductivo de teínas totales de una sub-muestra del pool de haber tenido al menos un parto anterior y en plasma seminal mediante espectrofotometría. condiciones reproductivas óptimas. El crite- Se utilizó un kit comercial (FAR Diagnostics, rio de selección se basó en la presencia de Italia) y se siguieron las indicaciones del fa- un folículo dominante mayor o igual a 7 mm bricante. La medición se hizo en un analiza- detectado por ecografía transrectal, median- dor bioquímico semiautomático (Sinowa, Chi- te el uso de un ecógrafo modelo ALOKA na). La concentración resultante fue de 0.7 SSD 500 y un transductor lineal Modo B de g/dl de proteínas totales y 0.4 g/dl de 7.5 MHz. Las evaluaciones ecográficas fue- albumina. Con base a estos resultados, se rea- ron realizadas por un mismo operador. To- lizó la posterior dilución del plasma seminal das las hembras seleccionadas recibieron las con fosfato salino bufferado (PBS), según los mismas condiciones de manejo (ausencia de tratamientos a ser aplicados. machos y bajo un sistema de pastoreo sobre pasturas naturales). Tratamientos Obtención del Plasma Seminal Tres días posteriores a la selección, se realizó una segunda ecografía a todas las Se colectó semen de cuatro alpacas, hembras con la finalidad de confirmar la pre- utilizando una vagina artificial adaptada de sencia de folículos >7 mm. Los animales se ovino, envuelta en una frazadilla eléctrica y distribuyeron aleatoriamente en cinco grupos colocada dentro de un maniquí. Se hizo un experimentales (Cuadro 1). A los animales mínimo de cinco colecciones por animal. El de cuatro grupos se les administró, vía semen colectado fue diluido 1:1 (v/v) con intramuscular, 1.5 ml del plasma seminal di- fosfato salino bufferado (PBS) y luido correspondiente (1:1, 1:2, 1:4 y 1:8). Al centrifugado a 700 g durante 30 minutos, para quinto grupo se le administró PBS (grupo separar la fracción celular del plasma control). seminal. El sobrenadante, plasma seminal, se decantó y evaluó al microscopio para confir- Diagnóstico ecográfico de la ovulación mar la ausencia de espermatozoides. Para evaluar la tasa de ovulación en Se mezcló el plasma seminal de todos cada uno de los tratamientos se realizaron los machos para eliminar factores de varia- evaluaciones ecográficas el día 2 después de ción individuales. Se le adicionó antibióticos iniciado el tratamiento (D2), donde se tomó (penicilina y estreptomicina, 10 µl/ml) y se como criterio de ovulación la desaparición del almacenó en tubos Falcon de 10 ml bajo con- folículo dominante observado al inicio del tra- gelación a -20 oC. tamiento (D0). 616 Rev Inv Vet Perú 2015; 26(4): 614-620 Efecto de cuatro diluciones de plasma seminal en la ovulación en alpacas Cuadro 1. Tratamientos experimentales1 Tratamiento Grupo Número de hembras (plasma seminal diluido con PBS) G1 1:1 (v/v) 10 G2 1:2 (v/v) 10 G3 1:4 (v/v) 10 G4 1:8 (v/v) 10 G5 PBS 4 1 Se aplicó 1.5 ml por vía intramuscular Cuadro 2. Tamaño del cuerpo lúteo (mm) en alpacas, al noveno día de la administración de plasma seminal diluido, vía intramuscular (n=10 hembras por tratamiento) Grupo Plasma seminal Cuerpo lúteo Rango diluido con PBS (mm) Inferior Superior G1 1:1 (v/v) 12.3 ± 2.0 9 15 G2 1:2 (v/v) 12.6 ± 1.7 10 15 G3 1:4 (v/v) 10.7 ± 1.7 8 14 G4 1:8 (v/v) 10.9 ± 1.4 9 13 Diagnóstico ecográfico del cuerpo lúteo ml y congelados hasta el análisis para deter- minar los niveles de progesterona mediante Una nueva evaluación ecográfica fue RIA, utilizando un kit comercial (DPC, realizada el día 9 de iniciado el tratamiento EEUU). (8° día posovulación) con el propósito de de- terminar la presencia y medir el tamaño del cuerpo lúteo. La ecografía fue realizada a Análisis Estadístico todas las hembras para descartar algún posi- ble error de visualización durante la verifica- Las diferencias en el tamaño del folícu- ción de la ovulación el día D . lo dominante por tratamiento se analizaron2 mediante el análisis de varianza de una vía; Determinación de progesterona sérica por las diferencias en la tasa de ovulación me- radioinmunoanálisis (RIA) diante la prueba de Fisher exacta; y las dife- rencias en el tamaño del cuerpo lúteo al no- Muestras de sangre fueron tomadas a veno día mediante Modelos Lineales Gene- todos los animales los días D0, D3, D6, D9 y ralizados (GLM) con medias repetidas. En el D12. La sangre fue centrifugada y el suero análisis estadístico se utilizó el programa SPSS resultante fue almacenado en viales de 1.5 v. 19. Rev Inv Vet Perú 2015; 26(4): 614-620 617 I. Reyna et al. Cuadro 3. Concentración de progesterona sérica (ng/ml) en alpacas ovuladas por efecto de la administración intramuscular de plasma seminal diluido Muestras Progesterona sérica (ng/ml) Grupo (n) D0 D3 D6 D9 D12 G1 10 0.05 ± 0.02 0.17 ± 0.02 2.52 ± 0.19 4.84 ± 0.20 0.75 ± 0.24 G2 10 0.05 ± 0.01 0.14 ± 0.02 2.18 ± 0.15 4.66 ± 0.26 0.55 ± 0.19 G3 10 0.05 ± 0.01 0.15 ± 0.02 1.66 ± 0.45 4.05± 0.29 0.29 ± 0.11 G4 10 0.05 ± 0.14 0.14 ± 0.03 1.62 ± 0.28 4.19 ± 0.19 0.50 ± 0.31 G5 4 0.05 ± 0.02 0.04 ± 0.01 RESULTADOS considerado de acuerdo al estudio de Bravo et al. (1991), quienes indican que la ovula- ción no ocurre en hembras con folículos me- Las ecografías de los animales en el día nores de 7 mm en el momento de la cópula. D0 indicaron que todos folículos eran mayo- res de 7 mm de diámetro, observándose el Los resultados del presente estudio se- menor diámetro promedio en los grupos G3 y G5 (8.5 mm) y el mayor promedio en el gru- ñalan que el plasma seminal diluido y aplica- po G4 (9.0 mm), aunque sin diferencias esta- do vía intramuscular causa la ovulación en el dísticas entre grupos. 100% de las alpacas, confirmando otros re-portes (López, 2004; Adams et al., 2005; Todos los animales de los cuatro grupos Vásquez, 2005). tratados con diferentes diluciones de plasma seminal llegaron a ovular en comparación con Los resultados sugieren que todas las las hembras que recibieron PBS (G5) donde diluciones del plasma seminal empleadas en no hubo ninguna ovulación. El diámetro del el presente estudio contienen niveles adecua- cuerpo lúteo varió entre 10.7 ± 1.70 en G3 a dos del factor inductor de ovulación, lo que 12.6 ± 1.7 en G2 (Cuadro 2), no existiendo ocasionó que todas las alpacas ovulen y for- diferencia estadística entre tratamientos. men cuerpos lúteos con capacidad secretora de progesterona, resultados que son simila- Se obtuvieron niveles basales de res a los hallados por Tanco (2008), quien progesterona sérica los días D0 y D3. La con- determinó que dosis de 500 µg (correspon- centración de progesterona en los 4 primeros diente a 1/6 de un eyaculado normal) conlle- grupos comenzó a elevarse en D6 y llegó a van a la formación de cuerpos lúteos con ma- los máximos valores en D9 (Cuadro 3), en yor diámetro en comparación con dosis de tanto que los niveles de progesterona en el 60 µg (1/50 de un eyaculado normal), indi- grupo G5 siempre fueron basales. No se en- cando que la ovulación y formación del cuer- contró diferencia estadística entre los grupos po lúteo es dependiente de la dosis del factor que presentaron ovulaciones. inductor de ovulación. Adams et al. (2005) demostraron que DISCUSIÓN el fenómeno ovulatorio es mediado por la hipófisis mediante una oleada preovulatoria El tamaño del folículo dominante toma- de LH, y reportando un incremento notorio do como criterio de selección (>7 mm) fue de LH en alpacas hembras tratadas con plas- 618 Rev Inv Vet Perú 2015; 26(4): 614-620 Efecto de cuatro diluciones de plasma seminal en la ovulación en alpacas ma seminal 1 h después del tratamiento, per- LITERATURA CITADA maneciendo con niveles constantes durante 8 h. 1. Adams GO, Sumar J, Ginther OJ. El máximo tamaño del cuerpo lúteo ocu- 1991. Form and function of the corpus rrió el día 9 del tratamiento, sin que hubiese luteum in llamas. Anim Reprod Sci 24: diferencias estadísticas entre grupos. Este 127-138. doi: 10.1016/0378-4320(91) resultado coincide con los resultados de de- 90088-H sarrollo luteal presentados por Fernández 2. Adams GP, Ratto MH, Huanca W, Baca et al. (1970) y Adams et al. (1991). Singh J. 2005. Ovulation-inducing fac- Asimismo, la mayor concentración de tor in the seminal plasma of alpacas and progesterona fue registrada al día 9 del trata- llamas. Biol Reprod 73: 452-457. doi: miento, correspondiente al octavo día de la 10.1095/biolreprod.105.040097 ovulación. Al respecto, Sumar (1988) deter- 3. Bravo W, Stabenfeldt G, Lasley B, minó que una concentración de progesterona Fowler M. 1991. The effect of ovarian mayor de 1 ng/ml a los 7 días del servicio era follicle size on pituitary and ovarian indicativo de ovulación y actividad luteal. La responses to copulation in domesticated ausencia de diferencia estadística en el ta- South American camelids. Biol Reprod maño del cuerpo lúteo y en los niveles de 45: 553-559. doi: 10.1095/biolre- progesterona entre grupos indica que las di- prod45.4.553 luciones empleadas en el estudio del plasma 4. Bravo W, Stabenfeldt G, Fowler M, seminal tendrían similar capacidad de inducir Lasley B. 1992. Pituitary response to ovulación y formación de cuerpo lúteo, aun- repeated copulation and/or gonadotropin- que Tanco (2008) pudo encontrar diferentes releasing hormone administration in lla- respuestas de progesterona sérica emplean- mas and alpacas. Biol Reprod 47: 884- do diferentes dosis del factor inductor purifi- 888. cado. 5. Chen B, Yuen Z, Pan G. 1985. Semen- induced ovulation in the bactrian camel El grupo G5, que recibió administración (Camelus bactrianus) J Reprod Fert 74: de PBS vía intramuscular, no evidenció ovu- 335-339. doi: 10.1530/jrf.0.0740335 lación alguna ni cambios en los niveles de 6. Fernández-Baca S, Madden D, progesterona sérica, coincidiendo con resul- Novoa C. 1970. Effect of different tados de otros autores que aplicaron similar mating stimuli on induction of ovulation solución de PBS a alpacas (López, 2004; in the alpaca. J Reprod Fert 22: 261-267. Adams et al., 2005; Vásquez, 2005; Panéz, doi: 10.1530/jrf.0.0220261 2007). 7. Fernández-Baca S, Sumar J, Novoa C. 1972. Actividad reproductiva de la alpaca mantenida en separación del ma- CONCLUSIONES cho. Memorias ALPA 7: 7-18. 8. Huanca W, Cárdenas O, Olazábal C,  Diluciones crecientes de plasma seminal Ratto M, Adams G. 2001. Efecto hor- aplicadas intramuscularmente a alpacas monal y empadre sobre el intervalo a la hembras indujeron la ovulación y forma- ovulación en llamas. Rev Inv Pec Supl ción de cuerpo lúteo en todos los anima- 1: 462-463. les. 9. Leyva V, García W. 1999. Efecto de la  No se encontraron diferencias estadísti- GnRH sobre la fertilización y cas entre grupos en relación al diámetro sobrevivencia embrionaria en alpacas. del cuerpo lúteo o concentración de En: II Congreso Mundial sobre progesterona. Camélidos. Cusco, Perú. Rev Inv Vet Perú 2015; 26(4): 614-620 619 I. Reyna et al. 10. López A. 2004. Inducción de la ovula- 1968. Aspects of reproduction in the al- ción en llamas mediante la administra- paca. J Reprod Fert 16: 395-399. doi: ción intramuscular del plasma seminal 10.1530/jrf.0.0160395 proveniente de llama, alpaca y bovino. 15. Sumar J. 1988. Removal of the ovaries Tesis de Médico Veterinario. Lima: Univ or ablation of the corpus luteum and its Nacional Mayor de San Marcos. 41 p. effect on the maintenance of gestation 11. Pan G, Chen Z, Liu X, Li D, Xie Q, in the alpaca and llama. Acta Vet Scan Ling F, Fang L. 2001. Isolation and 83 (Suppl): 133-141. purification of the ovulation-inducing fac- 16. Sumar J. 1997. Avances y perspecti- tor from seminal plasma in the Bactrian camel (Camelus bactrianus) Therioge- vas en reproducción de camélidos. En: nology. 55: 1863-1879. Memorias I Symposium Internacional 12. Panéz S. 2007. Efecto del sitio de de- Avances en Reproducción de Rumian- posición del plasma seminal sobre la tasa tes. Lima. de ovulación y formación del cuerpo 17. Tanco V. 2008. Biological characteri- lúteo en alpacas. Tesis de Médico Vete- zation of ovulation-inducing factor (OIF) rinario. Lima: Univ Nacional Mayor de in llama seminal plasma. Master of San Marcos. 64 p. Science Thesis. Canada: University of 13. Ríos M. 1989. Presencia de un factor Saskatchewan. 72 p. de inducción de la ovulación en el se- 18. Vásquez M. 2005. Efecto del plasma men de alpaca y toro. Tesis de Médico seminal separado en base al peso Veterinario. Lima: Univ Nacional Mayor molecular, sobre la inducción de ovula- de San Marcos. 30 p. ción en llamas. Tesis de Médico Veteri- 14. San Martín M, Copaira M, Zúñiga J, nario. Lima: Univ Nacional Mayor de Rodríguez R, Bustinza G, Acosta L. San Marcos. 50 p. 620 Rev Inv Vet Perú 2015; 26(4): 614-620