MINISTERIO DE AGRICULTURA Y RIEGO INSTITUTO NACIONAL DE INNOVACIÓN AGRARIA DIRECCIÓN DE DESAROLLO TECNOLÓGICO AGRARIO ESTACIÓN EXPERIMENTAL AGRARIA BAÑOS DEL INCA Manual Proyecto PNIA 002_PI “Evaluación de antigenicidad de una nanoformulación con antígenos de secretoma de Fasciola hepatica frente a fasciolosis en la región de Cajamarca” Manual: Protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas Tabla de para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes Ministerio de Agricultura y Riego Publicado: CONTENIDO Marzo del 2020 Ministro de Agricultura y Riego Primera edición: Ing. Jorge Luis Montenegro Chavesta Marzo, 2020 1. Introducción ....................................................................................................................... 5 Tiraje: Viceministro de Desarrollo e Infraestructura Agraria y Riego 1000 ejemplares 2. Clasificación taxonómica ...................................................................................................... 5 Econ. Carlos Alberto Ynga La Plata Impreso en: 3. Morfología general .............................................................................................................. 6 Viceministra de Políticas Agrarias Nombre de la imprenta: Martínez Compañón Editores 3.1. Adulto .................................................................................................................................................... 6 Econ. Paula Rosa Carrión Tello RUC: 20495926479 3.2. Miracidium ............................................................................................................................................ 6 Teléfono: (076) 361904 3.3. Esporocisto ............................................................................................................................................ 7 Jefe del INIA Dirección: Jr. Irene Silva de Santolalla 700 Urb. Horacio Zeballos, 3.4. Redia ..................................................................................................................................................... 7 Jorge Luis Maicelo Quintana, Ph. D. Cajamarca E-mail: gerencia@mceditores.com 3.5. Cercaria .................................................................................................................................................. 8 © Instituto Nacional de Innovación Agraria-INIA 3.6. Metacercaria .......................................................................................................................................... 8 ISBN: 978-9972-44-050-2 4. Ciclo biológico ...................................................................................................................... 9 Elaboración de contenido: MV. Marco Antonio Cabrera González, Dr. 5. Hospedero intermediario ................................................................................................... 11 MV. Sámy Káterin Chávez Díaz MV. José Leonardo Ravines Chávez 6. Hospedero definitivo ......................................................................................................... 11 Editado por: 7. Problemática en rumiantes ............................................................................................... 12 Instituto Nacional de Innovación Agraria - INIA 8. Problemática en humanos ................................................................................................. 12 Equipo Técnico de Edición y Publicaciones Av. La Molina 1981, Lima- Perú 9. Alternativa de control inmunológico .................................................................................. 13 (51 1) 240-2100 / 240-2350 www.inia.gob.pe 10. Protocolos de biología molecular ..................................................................................... 14 10.1. Extracción de proteína de intestino de Fasciola hepatica ...................................................................... 14 Editor general: 10.1.1 Cuantificación de proteína por espectrofotometría (método Bradford) .............................................................. 15 Eliana Alviárez Gutierrez, M.Sc. 10.2. Protocolos de electroforesis .................................................................................................................. 17 Revisión de contenido: 10.2.1 Electroforesis SDS-page ........................................................................................................................................ 17 Betty Flores Gonzales 10.2.2 Electroforesis 2D-bidimensional .......................................................................................................................... 21 Heillen Calderón Castillo 10.3. Extracción de ARN de Fasciola hepatica ................................................................................................ 25 Gabriela Salazar Alvarez 10.4. Producción de ADN complementario (ADNc) ........................................................................................ 27 10.5. Amplificación de ADN (Catepsina CL1) .................................................................................................. 29 Diseño y diagramación: 10.6. Electroforesis en gel de agarosa ........................................................................................................... 31 Abner Fernando Mio Torrejón Luis Carlos Arévalo Mercado 10.7. Purificación de productos de PCR ......................................................................................................... 33 Jeams López Acaro 10.8. Clonación del producto de PCR (Catepsina CL1) .. .................................................................................. 35 10.9. Transformación de células competentes ................................................................................................ 37 10.10. Multiplicación de células competentes transformadas .......................................................................... 41 10.11. Extracción de ADN plasmídico de bacterias transformadas ................................................................... 42 10.12. Encapsulación de ADN plasmídico con polímero biodegradable – ácido poliláctico (PLA) ...................... 45 11. Protocolo de evaluación preclínica de vacunación ............................................................. 47 11.1. Diseño del protocolo experimental ...................................................................................................... 47 11.2. Desafío experimental ........................................................................................................................... 49 11.3. Evaluación de los aspectos relacionados a inocuidad y toxicidad de vacuna ......................................... 50 11.4. Análisis de la función hepática y renal .................................................................................................. 50 11.5. Evaluación de parámetros hematológicos ............................................................................................. 51 11.6. Evaluación del perfil humoral ............................................................................................................... 51 Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú N° 2020-03112 12. Referencias ....................................................................................................................... 52 Prohibida la reproducción de este libro por cualquier medio, total o parcialmente, sin permiso expreso. Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 1. INTRODUCCIÓN “La fasciolosis” es una zoonosis parasitaria causada por el tremátodo Fasciola hepatica, afecta al hígado del humano y animales herbívoros como vacunos, ovinos, caprinos y equinos, entre otros. En el Perú es considerado un problema de salud pública por la alta prevalencia de infecciones en humanos, especialmente en niños y un problema veterinario de importancia por las altas tasas de infección del ganado en varias regiones del país (Espinoza, Terashima, Herrera y Marcos, 2010). Frente a este problema nuestro grupo de investigación, en el marco del proyecto 002_PI - PNIA “Evaluación de la antigenicidad de una nanoformulación con antígenos de secretoma de Fasciola hepatica frente a la fasciolosis en la region de Cajamarca“, planteó como objetivo desarrollar una vacuna de ADN recombinante a partir del gen de catepsina (CL1), como profilaxis para el control de este tremátodo en rumiantes. El presente documento “Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes” tiene como objetivo difundir el uso de estos procedimiento entre el personal profesional y técnico relacionado al desarrollo de la ganadaria. Este manual es la compilación de los protocolos de biología molecular empleados y estandarizados para la elaboración de vacunas genéticas de tercera generación para el control de Fasciola hepatica, el cual fue elaborado en el Laboratorio de Biotecnología – Sanidad animal de la Estación Experimental Agraria Baños del Inca del Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA). 2. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA Cordero et al. (1999) citado por Cabanillas (2018), clasifica taxonómicamente a Fasciola hepatica de la siguiente manera: Phylum Platyhelminthes Sub phylium Cercomeria Súper clase Cercomeridea Clase Trematoda Sub clase Digeneo Orden Fascioliformes Súper familia Fascioloidea Familia Fasciolidae Sub familia Fasciolinae Género y Especie Fasciola hepatica Linnaeus, 1758 5 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 3. MORFOLOGÍA DE Fasciola hepatica 3.1. Adulto Aplanado, en forma de hoja, mide 18 a 50 mm de largo por 4 a 13 mm de ancho; de color gris cuando el parásito es conservado en formol y pardo grisácea cuando se encuentra fresco (Figura 1). En su extremo anterior presenta el cono cefálico y se distinguen dos ventosas útiles, una oral que rodea la boca y la otra ventral (Cordero et al., 1999). El aparato digestivo es incompleto, formado por una cavidad bucal pequeña, una faringe musculosa y un esófago que se separa en dos ramas laterales que finalizan en ciegos intestinales. En relación al aparato reproductor, son hermafroditas, con el poro genital en posición anterior a la ventosa ventral y con genitales masculino y femenino ramificados; presenta saco del cirro entre la ventosa oral y ventral, un par de testículos, un corto útero lleno de huevos ubicado delante del ovario y glándulas vitelógenas distribuidas en los campos laterales del cuerpo. El sistema nervioso presenta un collar de tejido especializado, el cual rodea con largos Figura 2. Estadio miracidium de Fasciola hepatica. cordones nerviosos, el extremo anterior del tubo alimenticio. Este parásito no posee ningún órgano sensorial (Huaccha, 2008). 3.3. Esporocisto Larva en forma de saco, mide aproximadamente de 1 mm (Figura 3). Carece de aparato digestivo, nervioso y reproductor (Figura 3). Al no poseer boca, se piensa que los nutrientes los obtienen a través de la pared de su cuerpo (Romero, 2007). Figura 1. Morfología del estadio adulto de Fasciola hepatica. Fuente: Haro, s.f. 3.2. Miracidium Figura 3. Estadio esporocisto de Fasciola hepatica. Larva ciliada, mide aproximadamente 128 μm por 25 μm (Figura 2), presenta manchas oculares, una Fuente: Carrada-Bravo, 2007 papila móvil y una glándula apical. El sistema excretor es rudimentario y posee un grupo de células 3.4. Redia germinativas, que son las progenitoras de la siguiente generación de estadios larvales. El miracidium surge de la eclosión del huevo del parásito y tiene como objetivo principal buscar al hospedero Larva en forma de saco alargado, mide entre 1 - 3 mm (Figura 4). En el extremo anterior, presenta una intermediario, un caracol del género Lymnaea. (Barriga, 2002; Drugueri, 2005; Romero,2007; Urquhart, boca que se comunica con una faringe musculosa. Posee masas germinales y a diferencia del parásito Armur, Duncan, Dunn y Jennigs, 2001). adulto, tiene un sistema excretor con menor número de células flamígeras y dos poros excretores (Romero, 2007; Rojas, 2004). 6 7 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes Figura 4. Estadio redia de Fasciola hepatica. Fuente: Tello, 2012 Figura 6. Estadio metacercaria de Fasciola hepatica. 3.5. Cercaria 4. CICLO BIOLÓGICO Larva móvil, mide aproximadamente 260 - 320 μm por 200 - 240 μm, posee un flagelo terminal a manera de cola (Figura 5). Además, presentan ventosas, ciegos intestinales, aparato excretor, sistema nervioso, Presenta un ciclo biológico de tipo indirecto, es decir requiere de la participación de un hospedero definitivo, primordio genital y glándulas cistógenas oscuras y granulares (Barriga, 2002; Romero, 2007). donde se produce la reproducción sexual y un hospedero intermediario, donde se da la reproducción asexual (Figura 7) (Gallego, 2007; Gonzáles, 2001). En el hospedero definitivo, los parásitos adultos se localizan en los conductos biliares; donde depositarán sus huevos, luego estos serán trasladados por la bilis al intestino delgado a través del conducto colédoco para finalmente ser arrastrados juntos con las heces hacia el exterior. La forma adulta de Fasciola hepatica, puede despositar en el hospedero, en promedio 20 000 huevos por día dependiendo de diversos factores, como el grado de parasitación, edad del hospedero y tiempo de infección (Carrada-Bravo, 2007; Gallego, 2007). En el medio ambiente, los huevos necesitan de 9 a 15 días para su incubación y la eclosión se verá influenciada por factores ambientales como la temperatura, humedad, dióxido de carbono y oxígeno; siendo la temperatura, uno de los factores que afecta considerablemente el tiempo de eclosión. Para la eclosión, la temperatura puede variar entre 10 - 30 °C, sin embargo; a temperaturas inferiores a 10 °C el desarrollo se detiene (Mas-Coma, Estaban y Bargues, 1999; Browman, Linne y Eberhard, 2004; Romero, 2007). Figura 5. Estadio cercaria de Fasciola hepatica. Después de la eclosión emerge el miracidio, que nada libremente para encontrar al hospedero intermediario, el caracol del género Lymnaea. El miracidium tiene la urgencia de encontrar a su hospedero en menos de 24 horas, 3.6. Metacercaria ya que sus reservas energéticas son limitadas, de lo contrario morirá. Mediante contracciones musculares y movimientos ciliares la larva ingresa al pie del caracol, luego migrará hacia la cámara pulmonar para dar origen Forma infectante para el hospedero definitivo, generalmente se encuentra en zonas con alta humedad, al esporocisto, donde cada uno de ellos, aproximadamente en 15 días, dará lugar a la primera generación de enquistada entre la vegetación que normalmente es consumida por los animales. Este estadio presenta redias (entre cinco y ocho redias) y si las condiciones medioambientales no resultan favorables para el caracol, forma esférica y a veces ovalada, mide aproximadamente 250 - 300 μm por 200 - 250 μm. Su composición se forma la segunda generación de redias, mediante multiplicación asexual; de ser lo contrario la siguiente se asemeja a la del parásito adulto, excepto por la presencia de gónadas no funcionales (Figura 6). generación es de cercarias. Se ha calculado que aproximadamente 250 cercarias se forman a partir de cada miracidium. En condiciones naturales, el desarrollo completo dentro del hospedador se da entre 7 a 10 semanas Pueden sobrevivir hasta 13 meses en este estado ya que presentan una pared conformada por 4 capas, lo (Barriga, 2002; Romero, 2007; Rojas, 2004; Soulsby, 1987). que le confiere alta resistencia a bajas temperaturas; inclusive si las pasturas infectadas están cubiertas por nieve, sin embargo estos quistes son muy susceptibles a la desecación (Romero, 2007). 8 9 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes Las cercarias, al salir del hospedador intermediario, rápidamente se enquistan en las hojas de las plantas e 5. HOSPEDERO INTERMEDIO inclusive en el agua, para luego perder la cola móvil. Mediante sus glándulas cistógenas las cercarias secretan una cubierta resistente que contribuye al proceso de enquistamiento que dará origen a las metacercarias. Las metacercarias resisten mejor las temperaturas bajas, pero son susceptibles a las temperaturas altas y algunas Los caracoles clasificados dentro del género Lymnaea (Galba) actúan habitualmente como hospedador pueden enquistarse en el agua en donde permanecen en suspensión adheridas a las burbujas (Barriga, 2004; intermediario de F. hepatica. Su principal exponente,presente en todos los países europeos y con evidencias Romero, 2007; Gallego, 2007; Acha y Szyfres, 2003). en Sudamérica y África, es Galba truncatula (Graczyk & Fried, 1999). El hospedero definitivo se infecta después de ingerir alimento contaminado con metacercarias, las cuales se La concha es helicoidal, ovalada que se enrolla hacia la derecha en plano vertical, lo que le brinda la desenquistan en el intestino delgado y liberan la fasciola juvenil. Estas pasan la pared del duodeno y migran denominación de dextrógira; son de color pardo grisáceo, su el tamaño varía entre 1 mm a 10 mm (Figura 8). por el peritoneo, después de dos horas de ingestión; luego alrededor de 2 a 6 días migran por el parénquima Además, presentan un peristoma simple y carecen de opérculo (Soulsby, 1987). hepático después de penetrar la cápsula de Glisson del hígado. Esta fasciola juvenil ubicada en los conductos biliares, alcanzan la madurez sexual al cabo de 8 a 10 semanas y ya son capaces de producir huevos. Entre 8 Se desarrollan en terrenos con humedad permanente como riachuelos, abrevaderos, charcos, praderas inundadas, y 100 semanas post infección, estos huevos saldrán al medio ambiente junto con las heces (Olaechea, 2007; entre otros, donde la corriente es lenta y de agua dulce. En condiciones climáticas adecuadas de temperatura y Gallego, 2007; Londoñe, Chávez, Li, Suárez y Pezo, 2009; Leguía, 1991). humedad, un solo caracol puede producir hasta 25 000 descendientes y pueden hibernar en el subsuelo húmedo logrando sobrevivir en condiciones ambientales desfavorables hasta por un año (Soulsby, 1987). Los caracoles adultos que llegan a sobrevivir al invierno, depositan sus huevos en la primavera y continúan haciéndolo durante el verano hasta que mueren; de esta manera, se observa una generación y media en un año (Boray, 1997; Malone et al, 1998). Figura 8. Galba truncatula, hospedero Intermedio de F. hepatica. Figura 7. Ciclo biológico de Fasciola hepatica. Fuente: Cordero, 2016 modificado de Fiel, 2012 6. HOSPEDERO DEFINITIVO Fasciola hepatica, posee una amplia variedad de hospederos definitivos, en los que se encuentran los mamíferos domésticos de importancia ganadera como bovinos, ovinos, camélidos, caballos, burros, cabras, cerdos, cuyes , conejos, y algunas especies silvestres; además del hombre (Torgerson, 1999). 10 11 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 7. PROBLEMÁTICA EN RUMIANTES Cajabamba y Celendín, se reportó una frecuencia relativa de 10.9 %. En la investigación se recuperaron 248 fichas epidemiológicas, donde 27 niños resultaron positivos en la prueba de ELISA (Orfanos, Cabanillas y En el Perú, la fasciolosis es considerado un problema veterinario presente en las zonas de cría de vacunos, León, 2010). principalmente en regiones cercanas a la Cordillera de los Andes. Esta enfermedad fue considerada clásicamente como una parasitosis esporádica y accidental para el hombre; sin embargo, el incremento de Por otro lado, en un estudio realizado a un grupo de 476 niños, cuyas edades fluctuaban de 2 a 18 años casos en humanos, en los últimos años, ha determinado que esta parasitosis sea una enfermedad emergente de edad, en seis localidades rurales ubicadas entre 2 627 - 3 061 m.s.n.m. en la provincia de Cajamarca, se y de importancia en salud pública (Marcos et al., 2007). reportó una prevalencia de fasciolosis que variaba entre 6.7 y 47.7 % (media 24.4 %); siendo este resultado el valor mas alto registrado hasta ahora en esa área, encontrando además una carga parasitaria entre 24 y 864 Cajamarca es una de las regiones andinas peruanas endémicas que posee alta prevalencias de fasciolosis, huevos por gramo y ninguna diferencia significativa entre sexo y edad (Gonzáles, 2011). causando un notable impacto en la salud y economía regional. Estudios en animales indican tasas de infección de aproximadamente 75 % en ganado vacuno, 45 % en ovinos, 23 % en porcinos y 14 % en caprinos; encontrándose además, que las mayores tasas están en la provincia de Cajamarca (Huaccha, 2008). 9. ALTERNATIVA DE CONTROL INMUNOLÓGICO En 1991, las pérdidas causadas por la faciolosis se estimaron en 11 millones de dólares por año; recientemente, Los fármacos empleados frente a Fasciola hepatica pueden proporcionar una cura para la infección; no se ha calculado que las pérdidas anuales en producción láctea y carne son de 12 millones de dólares en la obstante, debido al desarrollo continuo de parásitos resistentes a los fármacos y las altas tasas de reinfección región de Cajamarca. Las pérdidas se estiman sobre la base que la región de Cajamarca tiene una población en áreas endémicas, donde esta parasitosis es de ocurrencia regular, se requieren de nuevas estrategias de de 604 700 cabezas de ganado vacuno (Instituto Nacional de Estadística e Informática - INEI, 1998), además, control contra este parásito. Varios estudios de vacunas en rumiantes que emplean diferentes antígenos se estimó una reducción en el rendimiento de leche entre 8 a 20 % dependiendo de la intensidad de la candidatos, entre los que se encuentran la proteína de unión a los ácidos grasos, glutatión-s-transferasa, infección (INEI, 1998), así también se consideró la disminución de la ganancia de peso en hasta 8 % la eficacia leucina aminopeptidasa y catepsina L1 y L2, han probado ser prometedores (Toet, Piedrafita y Spithill, 2014). de conversión de alimentos hasta 11 %. Adicionalmente, los costos por tratamiento con antihelmínticos frente a Fasciola hepatica es el mayor componente de pérdida económica, ya que los animales son tratados Las proteasas secretadas por los parásitos son importantes para el establecimiento exitoso de la interacción hasta más de tres veces por año (Claxton et al., 1998), con un costo de aproximado de 5.6 millones de dólares del parásito en el huésped, incluida la invasión, destrucción de los tejidos del huésped, penetración de los americanos por año lo que representa 46.6 % de la pérdida total. sistemas vasculares del huésped y la migración hacia su micro hábitat; siendo estas proteasas usadas como objetivo quimioterapéutico o de vacunas (Sajid y Mckerrow, 2002). El uso de las drogas antihelmínticas es una de las estrategias más utilizadas y efectivas para contrarrestar la fasciolosis hepática en distintas especies de animales a nivel mundial. Entre los diversos fármacos existentes, La localización de los sitios de liberación de antígeno en el parásito podría explotarse para diversas estrategias el triclabendazol es una de los mas empleados, Fairweather y Boray (1999), reportan su uso en rumientes a de control, ya que nos permite especular sobre la relación de su función probable y su fuente de liberación. partir de los años 80. Sin embargo uno de los problemas más críticos sobre el uso de fármacos en el control La liberación de proteínas y enzimas en parásitos se ha observado en órganos altamente especializados como de parásitos es la resistencia antihelmíntica. el intestino, gónadas y en el tegumento del parásito (Krailas et al., 1999; Abdel-Rahman, OReilly y Malone, 1999; Anuracpreeda, Wanichanon y Sobhon, 2009). La resistencia de Fasciola hepatica al triclabendazol fue reportada por primera vez en Cajamarca, en un estudio realizado a un grupo de bovinos del fundo El Cortijo - valle de Cajamarca, donde se encontró una La proteasa catepsina L1 (CL1) se almacena en su forma inactiva en vesículas secretoras de las células eficacia del farmaco de 3.1 % (Rojas, 2007). En otro estudio realizado a un grupo de 15 bovinos, en el dia 28 epiteliales gastrodérmicas y luego se secretan en el lumen del intestino del parásito en grandes cantidades post dosificación de triclabendazol y closantel, se encontraron eficacias del 77 % y 25 % respectivamente en antes de ser liberadas en los tejidos del huésped (Dalton y Hefferman, Collins et al., 2004). Santa Elvira - distrito San Juan, 6 % y 0 % en San Luis - distrito Gregorio Pita y de 81 % y 85 % en Quebrada Honda–distrito Tumbadén (Rojas, 2007). Frente a esta problemática de alta incidencia y prevalencia de fasciolosis en rumiantes y en niños, en especial en el área rural en la región de Cajamarca y teniendo en cuenta que el parásito expresa resistencia antihelmíntica Recientemente Ortiz (2013), reportó una falta de eficacia clínica de triclabendazol (TCBZ) después de tratar a los principales fármacos utilizados en su control, se ha planteado el dearrollo del proyecto “Evaluación una población de ganado lechero en Cajamarca, encotrando una eficacia del antiparasitario del 25.2 % , lo de una nanoformulación con antígenos de secretoma de Fasciola hepatica frente fasciolosis en la Región que confirma la resistencia a TCBZ de Fasciola hepatica . de Cajamarca”, que tiene como objetivo reducir los índices de prevalencia e incidencia de esta parasitosis, para este fin se realizó actividades de laboratorio conducentes a la elaboración de un prototipo de vacuna a base de ADN recombinante de catepsina CL1 de Fasciola hepatica, cuyos protocolos se estandarizaron en 8. PROBLEMÁTICA EN HUMANOS el laboratorio de biotecnología de la Estación Experimental Agraria Baños del Inca los cuales se describen a continuación. La fasciolosis humana, es una de las enfermedades parasitarias mas importantes en el Perú, debido a las altas tasas de prevalencia registradas en los últimos años. En el estudio “Prevalencia de fasciolosis en humanos en la región Cajamarca – periodo 2010” realizado en niños en edad escolar de las provincias de San Marcos, 12 13 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 1 0. PROTOCOLOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 4. Fragmentar y homogenizar los intestino de Fasciola hepatica introduciendo los tubos, conteniendo 20 intestinos de Fasciola hepatica, en nitrógeno líquido por 20 segundos (repetir este paso 3 veces). 10.1. Extracción de proteína de intestino de Fasciola hepatica 5. Colocar las muestras en el mortero y tritutar hasta que los intestinos tomen consistencia pastosa, colectar la pasta y colocar en nuevos tubos de 1.5 ml. El protocolo tiene como objetivo cuantificar el contenido de proteína y caracterizar antígenos de F. hepatica mediante electroforesis SDS-PAGE y electroforesis 2D-bidimensional. 6. Agregar 1.5 ml de PBS al tubo que contiene la pasta de intestinos. Homogenizar en el vórtex hasta disgregar la muestra. Reactivos Materiales y equipos 7. Centrifugar a 14 000 xg durante 10 minutos a 4 °C.  Kit de extracción de proteína (BugBuster®)  Tubos eppendorf de 1.5 ml 8. Decantar, procurando eliminar la mayor cantidad de liquido, y dejar secar el pellet a temperatura  Nitrógeno líquido  Buffer fosfato salino (PBS) ambiente.  Recipiente con hielo picado  Medio RPMI-1140 9. Suspender el sedimento con el reactivo BugBuster® a temperatura ambiente y mezclar por pipeteo o  Mortero porcelana agitación suave durante 20 minutos. Emplear 300 µI de BugBuster® para 500 µI de muestra.  Gradilla para tubos eppendorf de 1.5 ml  Recipiente para descarte de líquidos 10. Incubar la suspensión en una plataforma agitadora en ajuste lento durante 10 - 20 minutos a temperatura ambiente.  Recipiente para descarte de puntas  Baño maría 11. Eliminar los residuos celulares insolubles por centrifugación a 16 000 xg durante 20 minutos a 4 °C. Almacenar  Vórtex la proteína a -20 °C.  Estereomicroscopio 10.1.1. Cuantificación de proteína por espectrofotometría (Método Bradford)  Centrifuga  Suero fisiológico 0.9 % 1. Añadir el reactivo de Bradfrod a la extracción de proteína de intestino de Fasciola hepatica y al patrón de referencia, mezclar.  Pipetas automáticas  Puntas libres de ARNasa 2. Cuantificar las muestras en el espectrofotómetro. Levantar el brazo del equipo y colocar en el lector  Algodón inferior del mismo 2 µI de muestra, bajar el brazo del equipo e iniciar la medición de la absorbancia a 595 nm de longitud de onda.  Papel toalla  Marcador para rotular Procedimiento 1. Extraer formas adultas de Fasciola hepatica de hígados infectados de ganado vacuno u ovino y colocarlos en tubos de 50 ml conteniendo suero fisiológico 0.9 %. Conservar a 37 °C. 2. Lavar los parásitos adultos varias veces con medio RPMI-1140 a una temperatura de 37 °C hasta la eliminación de contenido intestinal. 3. Colocar los parásitos en placas de petri, con la ayuda del estereomicroscopio diseccionar (Figura 9) y extraer los intestinos de 20 individuos. Colectar (Figura 10) y conservar en 100 µI de fosfato buffer salino en tubos de 1.5 ml y llevar a congelación a -20 °C hasta posterior uso (Figura 11). 14 15 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 10.2. Protocolos de electroforesis 10.2.1. Electroforesis SDS-PAGE Esta técnica permite la separación de moléculas de acuerdo a su movilidad a través de un campo eléctrico, donde las moléculas se separan en función de su carga eléctrica, desplazándose al electrodo de carga contraria. Para que esta dependencia sea correcta, es necesario romper los puentes disulfuro de la proteína, por lo que es usual añadir durante la preparación de muestra un agente reductor, generalmente 2-mercaptoetanol (Laemmli, 1970). Reactivos Materiales y equipos  Acrilamida  Equipo de electroforesis vertical  Bis-acrilamida  Cámara de electroforesis Figura 9. Disección de Fasciola hepatica.  Sodium dodecil sulfato (SDS)  Peines y separadores  Agua destilada  Formador de geles  Persulfato de amónio (APS)  Pipetas automáticas  Ditiotreitol (DTT)  Gradilla para tubos eppendorf de 1.5 ml  TEMED (N,N,N’,N’ tetrametiletilendiamina)  Recipiente para descarte de líquidos  2-mercaptoetanol  Recipiente para descarte de puntas  Azul de bromofenol  Agitador magnético  Glicerol  Guantes  Tris base  Papel toalla  Glicina  Marcador para rotular  Metanol  Ácido acético Figura 10. Colección de intestino de Fasciola hepatica.  Marcador de peso molecular de proteína Procedimiento 1. Preparar las soluciones stock como se indica a continuación: • Solución de acrilamida stock (30 %) Acrilamida 29.2 g Bis-acrilamida 0.8 g Agua destilada 100 ml Disolver, filtrar y almacenar a 4 °C en oscuridad. Figura 11. Almacenamiento de intestino de Fasciola hepatica en PBS. 16 17 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes • Buffer tris (1.5 M), pH 8.8 • Solución decolorante Tris base 18.15 g Metanol 200 ml Agua destilada 50 ml Ácido acetico glacial 100 ml Disolver y ajustar el pH a 8.8 con HCl al 50 % (50 % agua destilada y 50 % HCl ). Llevar a 100 ml con agua Agua bidestilada 700 ml destilada. Mezclar. • APS (10%) (preparar al momento de uso) • Buffer tris (0.5M), pH 6.8 Persulfato de amonio 500 mg Tris base 3 g Agua destilada 5 ml Agua destilada 25 ml Mezclar y guardar en tubos eppendorf a refrigeración. Disolver, ajustar pH a 6.8 con HCl. Llevar a 50 ml con agua destilada. • DTT / azul de bromofenol • SDS (10 %) DTT 1.39 g SDS 2 g Azul de bromofenol (0.1 %) 6 ml Agua bidestilada 20 ml Mezclar y disolver. Disolver con la ayuda de un agitador magnético. • Buffer de corrida Tris base 3.03 g • Coctel de muestra (preparar antes del uso) Glicina 14.42 g Buffer tris (0.5M), pH 6.8 1.88 ml SDS 1 g SDS (10 % ) 6 ml Agua destilada 1 l Glicerol 3 ml Mezclar y disolver. Agua bidestilada 2.2 ml 2. Limpiar y armar las placas del equipo de electroforesis vertical MiniProtean® System (Bio-rad). Mezclar. 3. Preparar los geles de poliacrilamida como se describe a continuación. • Azul de bromofenol (0.1 %) • Gel de separación (12. 5 %) Azul de bromofenol 10 mg Acrilamida stock 6.25 ml Agua destilada 10 ml Buffer tris pH 8.8 5.6 ml Mezclar, tomar 0.6 ml de la solución y diluir 130 mg de DTT. Alicuotar 100 µl en tubos eppendorf de 250 Agua destilada 3.1 ml µI y almacenar a -20 °C. SDS (10 %) 150 µI APS (10 %) 200 µI • Azul de coomassie R250 (tinción de proteínas) TEMED 40 µI Azul brillante de coomassie 1 g Esperar de 10 a 15 minutos para polimerizar. Metanol 450 ml Agua destilada 450 ml Ácido acético (concentrado) 100 ml Mezclar y disolver. 18 19 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes • Gel de concentración (5 %) 10.2.2. Electroforesis 2D-Bidimensional Acrilamida stock 1.67ml Es una técnica de alta resolución que permite la separacion secuencial de proteínas mediante dos criterios físicos. Buffer tris (0.5M), pH 6.8 1.25 ml En primer lugar, son separadas en un gel con gradiente de pH, en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su Agua destilada 7.03 ml punto isoeléctrico (isoelectroenfoque). Tras esta separación por carga, las proteínas son separadas de acuerdo a su SDS (10 %) 100 µI masa molecular por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). APS (10 %) 150 µI TEMED 30 µI Reactivos Materiales y equipos Cargar las muestas en los carriles del gel de poliacrilamida, aplicar 150 voltios por 4 - 5 horas. Luego de la tinción se obtendrá un patrón de corrida (figura 12).  Buffer fosfato salino (PBS)  Espectrofotómetro  Nitrógeno líquido  Centrífuga refrigerada  Kit de Extracción de proteínas (BugBuster®)  Micropipetas automáticas  Tiras de poliacrilamida immobiline™ DryStrip  Agitador magnético gel de 7cm, pH 3-10 NL.  Equipo de isoelectroenfoque (IEF)  Buffer IPG pH 3-10 NL  Cámara para hidratación de tiras IPG  Solución de rehidratación DeStreak™.  Cámara de electroforesis vertical y accesorios  Aceite mineral Dry Strip Cover Fluid  Fuente de poder  Sealing Solution  Baño maría  Tris-HCI  Horno microondas  Tris base  Vórtex  Sodium dodecil sulfate (SDS)  pH-metro  Persulfato de amonio (APS)  Balanza analítica  Glicina  Incubadora  Glicerol  Cabina de flujo laminar  Azul de bromofenol  Refrigeradora  Dithiothreitol (DTT)  Guantes  lodoacetamida  Papel toalla  2-mercaptoethanol  Marcador para rotular Figura 12. Patrón de antígenos somáticos de Fasciola hepatica en SDS-PAGE (tinción con  Sulfato de amonio azul brillante de coomassie).  Acrilamida  Bis-acrilamida  Urea  TEMED (N,N,N’,N’ tetrametiletilenodiamina)  Marcador de peso molecular de proteína  Agua milli-Q  Metanol  Ácido acético  Azul brillante de comassie  Ácido clorhídrico (HCl)  Etanol absoluto  Agua destilada 20 21 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes Procedimiento 10. Agregar al segundo tubo 125 mg de iodoacetamida por 5 ml de solución de equilibrio. 1. Rehidratar las tiras lmmobiline DryStrip. Añadir el buffer IPG pH 3-10 NL (Bio-rad) a la solución de 11. Insertar la tira lmmobiline Dry Strip en el primer tubo. Tapar y sellar con papel parafilm durante 15 rehidratación DeStreak TM (Bio-rad). minutos. 2. Resuspender la proteína de intestino de Fascíola hepatica con el buffer de rehidratación. Pipetear la 12. Luego insertar la tira lmmobiline Dry Strip en el segundo tubo. Tapar y sellar durante 15 minutos. solución de rehidratación en el carril de la cámara de rehidratación IPG Box™ (GE Healthcare). Distribuir Conservar la tira en un tubo. la solución uniformemente. 13. Para la segunda dimensión (SDS-PAGE), limpiar y armar las placas del equipo de electroforesis vertical 3. Retirar con unas pinzas la cinta protectora de la tira de poliacrilamida lmmobiline™ DryStrip gel (IPG MiniProtean® System (Bio-rad). Strip) de 7 cm, pH 3-10 NL (Bio-rad). Colocar en el carril con el gel hacia abajo en contacto con la solución de rehidratación. Evitar que queden atrapadas burbujas de aire debajo de la tira. 14. Preparar el gel de resolución a una concentración de 15 %, adicionar los componentes en orden y mezclar de manera uniforme. Pipetear el volumen de la solución de resolución entre las placas de vidrio de la 4. Sellar las tiras con 3 ml de aceite mineral DryStrip Cover Fluid (Bio- rad). cámara de electroforesis. Añadir 100 µI de butanol sobre la solución de resolución para evitar el ingreso de moléculas de oxígeno que retarden la polimerización. Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 5. Rehidratar las tiras lmmobiline DryStrip (7cm) como sigue a continuación. 15 a 30 minutos. Una vez formado el gel, eliminar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel varias veces con agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no polimerizada Volumen (µI) y el butanol. Solución de rehidratación DeStreak™ 103.75 Buffer IPG pH 3-10 1.25 Componentes del gel de resolución (15 %) Muestra de proteína 20 Volumen final por tira 125 Acrilamida/Bis-acrilamida (30 %) 2.5 ml Buffer tris-HCI (1.5 M), pH 8.8 1.3 ml Colocar las tiras en la cámara de rehidratación e incubar por 12 horas a temperatura ambiente. Agua milli-Q 1.1 ml SDS (10 %) 50 µI 6. En la primera dimensión, de isoelectroenfoque (IEF), colocar la tira lmmobiline DryStrip rehidratada en APS (10 %) 50 µI la bandeja del equipo de isoelectroenfoque PROTEAM IEF CELL® (Bio-rad), en dirección del polo positivo TEMED 2 µI al negativo. Volumen 5 µI 7. Sellar la tira con 2 ml de aceite mineral Dry Strip Cover Fluid. Encender y programar el tiempo y los voltajes de corrida en el sistema de isoelectroenfoque (IEF). Transcurrido el tiempo de corrida de la 15. Luego preparar el gel stacking o gel de concentración, como se indica a continuación. primera dimensión retirar las tiras y equilibrarlas para la segunda dimensión. Componentes del gel de concentración (5 %) 8. Equilibrar las tiras lmmobiline Dry Strip con el buffer de equilibrio (SDS). El volumen de buffer por tira es de 10 ml. Acrilamida/bis-acrilamida (30 %) 170 µI Buffer Tris-HCI (1M), pH 6.8 130 µI Buffer de equilibrio SDS Concentración final Agua milli-Q 680 µI Buffer tris-HCl pH 8.8 75 mM SDS (10 %) 10 µI Urea 6 M APS (10 %) 10 µI Glicerol 29.3 % (w/v) TEMED 1 µI SDS 2 % Volumen total 1 ml Azul de bromofenol 0.002 % (w/v) En la preparación, agitar uniformemente la mezcla para evitar la formación de burbujas. Asegurar que el Agua milli-Q completar hasta 200 ml TEMED y el APS se distribuyan en todo el volumen de la solución. Luego pipetear la solución de concentración entre las placas de la cámara de electroforesis, sobre el gel de resolución ya polimerizado. Colocar entre 9. Dividir el volumen del buffer de equilibrio en partes iguales (5 ml), en cada tubo de 15 ml. Agregar al ambas placas un peine adecuado, para formar los pocillos donde ingresarán la tira Immobiline DryStrip y el primer tubo 50 mg de DTT por 5 ml de solución de equilibrio. marcador de peso molecular. 22 23 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 17. Dejar polimerizar la poliacrilamida del gel de concentración por 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. 10.3. Extracción de ARN de Fasciola hepatica Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar los pocillos con agua destilada. El ARN se encarga de trasladar la información genética del ácido desoxirribonucleico (ADN) para la síntesis de las 18. Colocar la tira lmmobiline DryStrip equilibrada en el pocillo del gel, acoplar la tira al gel de concentración, proteínas. Es decir, el ARN copia la información de cada gen del ADN y luego pasa al citoplasma, donde se une al evitar los espacios entre ambos geles. Colocar la tira en sentido horizontal, de cátodo a ánodo y aplicar ribosoma para dirigir la síntesis proteica. El ARN se encuentra presente en el citoplasma de las células eucariotas el marcador de peso molecular en uno de los pocillos del gel de concentración. y procariotas; así mismo esta compuesto por nucleótidos unidos que forman cadenas. Cada nucleótido se encuentra constituido por: un azúcar (ribosa), un grupo fosfato y 4 bases nitrogenadas (adenina, guanina, uracilo 19. Cubrir la tira y el marcador de peso molecular con agarosa (sealing solution), calentar previamente la solución y citosina). El aislamiento de ARN de muestras de intestino de formas adultas de Fasciola hepatica con un kit en el microondas hasta que la agarosa este completamente disuelta.Tapar la cuba y asegurarse que los pocillos comercial tiene como objetivo obtener ARN purificado de alta calidad, el cual luego se empleará como molde del gel se encuentren totalmente cubiertos por el buffer. en la reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa (RT-PCR); donde este molde se transcribirá a ADN mediante una enzima de tipo transcriptasa inversa. Por cada molécula de acido ribonucleico mensajero 20. Conectar los electrodos uno positivo y otro negativo (rojo y negro) a la fuente de poder. Encender, (ARNm) se sintetiza una molécula de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) monocatenario que programar el voltaje y amperaje a 5 mA por 30 minutos para el gel de concentración y a 25 mA por posteriormente se ha de convertir en bicatenario utilizando una ADN polimerasa. 1 hora y 30 minutos aproximadamente para el gel de resolución. Dejar correr hasta que el frente de corrida llegue a la parte inferior. Reactivos Materiales y equipos 21. Desmontar el equipo al finalizar la electroforesis, remover el sistema que contiene el gel de poliacrilamida. Separar el gel de las placas de vidrio, hidratar con agua destilada. Conservar el gel en un recipiente con  Kit Gene Jet RNA Purification  Tubos eppendorf de 1.5 ml agua milli-Q. Thermo Fisher Scientific  Tubos eppendorf de 250 µI  Columnas Gene JET (purificación de ARN pre- 22. Para la coloración y visualización de las proteínas, colocar 100 ml de solución colorante azul brillante de Componentes ensamblados con tubo colector) coomassie G-250 en un recipiente de plástico. Cerrar el contenedor herméticamente. Colocar 250 ml de - Proteinasa K  Tubo colector de 2 ml solución decolorante en otro recipiente de plástico. Cierre el contenedor herméticamente. Precalentar el contenido de ambos recipientes a 55 °C en el baño de agua caliente. - Buffer de lisis  Tubo colector de 1.5 ml - Buffer de lavado 1  Recipiente con hielo picado 23. Agregar el gel (1.5 mm de espesor) a la solución de tinción e incubar durante 5 minutos. Enjuagar el gel - Buffer de lavado 2 con agua destilada. Transferir el gel teñido al recipiente que contiene la solución decolorante, incubar a - Agua libre de nucleasas 55 °C por 45 minutos. 24. Transferir el gel a un recipiente que contenga agua ultra pura y desteñir el gel de 10 - 30 minutos a Procedimiento temperatura ambiente con agitación suave. Conservar el gel en agua milli-Q. 1. Pesar el tejido (utilizar hasta 30 mg de tejido fresco o congelado), triturar con un mortero y nitrógeno líquido. Transferir el tejido lisado a un tubo de microcentrífuga contiendo 300 µI de buffer de lisis suplementado con β-mercaptoetanol o DTT. Mezclar en vórtex por 10 segundos y homogenizar el lisado con un rotor-estator. En este paso tener en consideración: • Dejar el tejido lisado sin el buffer de lisis puede resultar en ARN degradado. • Utilizar el tejido lisado directamente para la purificación de ARN y no almacenar. • Mezclar todo el material molido con el buffer de lisis, evitar que este se deseque en las paredes del tubo (esto puede causar la degradación del ARN). 2. Añadir 600 µI de solución de proteinasa K (10 µI de la proteinasa K diluída en 590 µl de buffer TE). Homogenizar en vórtex e incubar a 15 ° C - 25 °C por 10 minutos. Figura 13. Electroforesis 2D, patrón somático de antígenos de Fasciola hepatica. 24 25 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 3. Centrifugar a 12000 ×g durante 5 minutos, si el lisado se prepara a partir de cantidades inferiores a 10 10.4. Producción de ADN complementario (ADNc) mg de material de partida; o centrifugar por 10 minutos, si el lisado se prepara a partir de cantidades superiores a 10 mg. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga libre de ARNasa. La producción de ADNc apartir de ARN, es posible empleando la técnica de transcripción reversa. El protocolo descrito a continuación emplea un kit de transcripción diseñado para la conversión a ADNc monocatenario a 4. Añadir 450 µI de etanol (96 -100 %) y mezclar por pipeteo. partir de concentraciones bajas de ARN total (0.02 μg) de Fasciola hepatica. 5. Transferir hasta 700 µI de lisado a la columna de purificación de RNA Gene Jet insertada en un tubo colector. Reactivos Materiales y equipos Centrifugar la columna por 1 minuto a ≥12000 ×g. Desechar el flujo continuo y colocar la columna de purificación en un nuevo tubo de colector. Repetir este paso hasta que todo el lisado sea transferido a la columna.  Kit High Capacity cDNA Reverse Transcription  Tubo eppendorf de 1.5 ml 6. Añadir 700 µI de buffer de lavado 1 (complementado con etanol) a la columna de purificación y Thermo Fisher Scientific  Tubo eppendorf de 250 µI centrifugar durante 1 minuto a ≥12000 ×g. Descartar el líquido eluido y pasar la columna de purificación  Recipiente con hielo picado a un nuevo tubo colector. Componentes  Recipiente para descarte de líquidos - 10 x RT buffer  Recipiente para descarte de puntas 7. Añadir 600 µI de buffer de lavado 2 (suplementado con etanol) a la columna de purificación y centrifugar - 25 x dNTP mix (100 mM)  Vórtex durante 1 minuto a ≥12000 ×g. Desechar el flujo continuo y colocar la columna de purificación en un nuevo tubo colector. - 10 X RT randon primers  Centrifuga refrigerada - Transcripatasa reversa MultiScribe  Termociclador 8. Añadir 250 µI de buffer de lavado 2, a la columna de purificación de ARN y centrifugar durante 2 minutos - Inhibidor de ARNasa  Pipetas automáticas a ≥12000 ×g. - Agua libre de nucleasas  Puntas libres de ARNasa  Algodón 9. Para eluir el ARN de la columna, añadir 100 µI de agua libre de nucleasas al centro de la membrana de  Guantes la columna de purificación. Centrifugar por 1 minuto a ≥12000 ×g .  Papel toalla 10. Desechar la columna de purificación. Utilizar el ARN purificado para aplicaciones posteriores. Conservar  Marcador para rotular a -20 °C o -70 °C hasta su uso.  Cámara de flujo laminar 11. Para evaluar la concentración y calidad del ARN extraído, medir la concentración de la muestra al Procedimiento espectrofotómetro y realizar electroforesis en gel de agarosa respectivamente (Figura 14). 1. En una cabina de flujo laminar, preparar la mezcla que se indica a continuación: Volumen (µI) 10X RT Buffer 2 25X dNTP Mix (100 mM) 0.8 10X RT randon primers 2 Transcriptasa reversa MultiScribe 1 Inhibidor de ARNasa 1 Agua libre de nucleasas 3.2 Total 10 Figura 14. Evaluación de la calidad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa. 26 27 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 2. Agregar a la mezcla 10 µI de extacción de ARN y mezclar suavemente. 10.5. Amplificación de ADN (Catepsina CL1) 3. Sellar los tubos y centrifugar brevemente para eliminar burbujas. La técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica que consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico. Para llevar a cabo la amplificación es 4. Finalmente, colocar los tubos en el termociclador con el siguiente perfil térmico. necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia del fragmento a amplificar (gen). PASO 1 PASO 2 PASO 3 PASO 4 Reactivos Materiales y equipos TEMPERATURA 25 °C 37 °C 85°C 4°C TIEMPO 10 minutos 120 minutos 5 minutos indefinido  Buffer de reacción 5 X  Tubos eppendorf de 1.5 ml  dNTP mix  Tubos eppendorf de 250 µI  Primer forward  Recipiente para hielo  Primer reverse  Hielo picado  Agua ultra pura  Recipiente para descarte de líquidos  Enzima Taq polimerasa  Recipiente para descarte de puntas  Vórtex  Centrifuga refrigerada  Termociclador  Cabina de flujo laminar  Pipetas automáticas  Puntas libres de ARNasa  Guantes  Papel toalla  Marcador para rotular  Cabina de flujo laminar Procedimiento 1. En cabina de flujo laminar, preparar la mezcla como se indica a continuación: Buffer 5 X 19.75 µI dNTP mix 6 µI Primer forward 1 µI Primer reverse 1 µI Agua ultra pura 1 µI Taq enzima 10X RT Buffer 0.25 µI Total por reacción 30 µI 28 29 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes Para la amplificacion de la secuencias de catepsina CL1, emplear los primers descritos a continuación: 10.6 Electroforesis en gel de agarosa GAC TGG CGT GAA TCC GGT TA –Forward (491Fh-CL1) TAA CCG ACA GCC AAC ACT CC – Reverse (491Fh-CL1) Es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u otras macromoléculas, como ARN ) por su tamaño y Tamaño del amplicón: 491 pb carga. La electroforesis consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene las moléculas de interés. Con base en su tamaño y carga, las moléculas se desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a distintas ACT CAT CGT CGG AGT GTT CG – Forward (333Fh-CL1) velocidades, con lo que se separan unas de otras. TAA CCG GAT TCA CGC CAG TC – Reverse (333Fh-CL1) Tamaño del amplicón: 333 pb Reactivos Materiales y equipos 2. Adicionar a la mezcla 2 µI de ADNc y mezclar suavemente.  Agarosa  Cuba de electroforesis horizontal  Buffer tris acetato EDTA 50X (TAE 50X)  Soporte para preparar el gel 3. Sellar el tubo, centrifugar brevemente para eliminar burbujas.  Agua milli-Q  Peine  SYBR Green  Erlenmeyer 4. Colocar el tubo en el termociclador con el siguiente perfil térmico.  Horno microondas  Fuente de poder  Probeta  Recipiente para descarte de puntas NÚMERO DE CICLOS TEMPERATURA °C TIEMPO  Pipetas automáticas 1 95 10 minutos  Puntas libres de ARNasa 94 1 minuto  Guantes  Papel toalla 35 56 90 segundos  Marcador para rotular 72 10 segundos  Transiluminador 1 72 10 minutos Procedimiento 1 4 Indefinido 1. Pesar la cantidad de agarosa necesaria para un gel al 1 %. En un erlenmeyer agregar 1g de agarosa en 100 ml de buffer TAE 1X. 2. Colocar el erlenmeyer en el microondas hasta la disolución completa de la agarosa (solución transparente). 3. Esperar que el erlenmeyer se enfríe hasta 45 - 55 °C. 4. Añadir 7 µI de SYBR Green a una concentración de 10 000 X 5. Acondicionar el soporte con el peine para verter la solución de agarosa. 6. Después de solidificar, colocar el gel en la cuba de electroforesis horizontal, adicionar el buffer TAE 1X de modo que cubra el gel (1 cm). 7. Mezclar la muestra del PCR con el buffer de carga 6X (5 volúmenes de muestra + 1 volumen de buffer de carga). 8. Adicionar 6 µI de muestra, previamente preparada, por hoyo. Encender el equipo de electroforesis, programar la corrida a 100 voltios y dejar correr hasta que el colorante indicador se desplace 4 cm en el gel (Figura 16). 9. Retirar el gel de la cuba de electroforesis y visualizar las bandas en el transiluminador. 30 31 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 10.7. Purificación de productos de PCR Este protocolo nos permitirá obtener amplicones de PCR libre de contaminación de polimerasas, enzimas de restricción, dNTPs, cebadores, bufferes y sales que pueda influir negativamente con el proceso de clonación o reacciones posteriores. Reactivos Materiales y equipos  Kit Pure Link ®Quick PCR Purification  Tubos eppendorf de 1.5 ml Thermo Fisher Scientific  Tubos eppendorf de 250 µI  Recipiente con hielo picado Componentes  Recipiente para descarte de líquidos - Buffer de extracción  Recipiente para descarte de puntas - Etanol  Centrifuga refrigerada - Buffer de prelavado  Pipetas automáticas - Buffer de lavado  Puntas libres de ARNasa - Buffer de elución  Guantes  Papel toalla  Marcador para rotular  Transiluminador  Bisturí Procedimiento 1. En el transiluminador, ubicar el fragmento de ADN a purificar, cortar una rodaja de gel de hasta 200 mg conteniendo el fragmento de interés y colocarlo en un tubo eppendorf de 1.5 ml (Figura 17). Figura 16. Aplicación de muestras en gel de agarosa 1 %. 2. Añadir 200 µI de buffer de extracción, mezclar mediante pipeteo. Incubar la mezcla a 50 - 58 °C por 10 minutos en baño maría, hasta que la porción de gel se disuelva en en su totalidad. 3. Añadir 200 µI de etanol y mezclar por pipeteo. Transferir la mezcla a la columna de purificación conectado a un tubo colector. Centrifugar la columna por 60 segundos a 14 000 xg, desechar el flujo eluido y colocar la columna de purificación en un nuevo tubo de colector. 4. Añadir 200 µI de buffer de prelavado y centrifugar por 60 segundos a 14 000 xg. Desechar el flujo y colocar la columna de purificación en un nuevo tubo colector. 5. Para eliminar por completo el buffer de lavado residual, centrifugar la columna de purificación (vacia) por 1 minuto a 14 000 xg. 6. Para eluir el fragmento de interés, transferir la columna de purificación a un nuevo tubo de colecta. Añadir 10 µI de buffer de elución a la columna y centrifugar por 1 minuto a 14 000 xg . 7. Almacenar el eluido a -20 °C hasta posterior uso. 32 33 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 10.8. Clonación del producto de PCR (Catepsina CL1) en Vector - pGEM®-T Easy Los sistemas vectoriales pGEM®-T son sistemas convenientes para clonar productos de PCR generados por ciertas polimerasas termoestables. Estas polimerasas a menudo agregan una única desoxiadenosina, de forma independiente de la plantilla, a los extremos 3´de los fragmentos amplificados. El vector pre-linealizado pGEM®-T EASY (Figura 18) contiene salientes de 3´-T en el sitio de inserción para proporcionar un saliente compatible para los productos de PCR. Reactivos Materiales y equipos  Producto de PCR purificado (Catepsina CL1)  Tubos eppendorf de 1.5 ml  Vector pGEM®-T Easy Promega  Tubos eppendorf de 250 µI  T4 DNA ligasa  Recipiente con hielo picado  Buffer de ligación Promega 2X  Recipiente para descarte de líquidos  Recipiente para descarte de puntas  Pipetas automáticas  Puntas libres de ARNasa  Guantes  Papel toalla  Marcador para rotular  Cabina de flujo laminar Procedimiento 1. En cabina de flujo laminar realizar la mezcla de los componentes como se indica en la tabla 1 (Figura 19). Figura 17. Aislamiento del amplicón de catepsina CL1. Tabla 1 Componentes de la mezcla de ligación Componentes Cantidad final Vol.1 reacción Buffer de ligación (10X) 1X 2.0 µl Producto de PCR 300 ng Vector 100 ng Enzima T4 ADN ligasa 1 U 1.0 µl Agua ultra pura - Total 20.0 µl 2. Incubar a 4°C durante toda la noche (18 horas). 34 35 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 10.9. Transformación de células competentes La transformación genética es un proceso mediante el cual la célula capta moléculas de ADN libre y las mantiene en su interior en forma de un replicón extra cromosómico o las incorpora a su genoma por recombinación homóloga, donde las secuencias de nucleótidos se intercambian entre dos moléculas similares o idénticas de ADN (Sinha y Redfield, 2012). Para que la transformación tenga lugar, la célula receptora tiene que encontrarse en estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula. Reactivos Materiales y equipos Figura 18. Vector pGEM®-T Easy.  Células competentes JM109  Cabina de flujo laminar  Medio Luria Bertani líquido (LB)  Incubador giratorio shaker  Medio LB sólido  Hielo picado  Medio de líquido 2xYT  Recipiente para desecho de puntas  Solución stock de isopropil-β-D-1-  Equipo de baño maría a 42 °C tiogalactopiranósido (IPTG), 100 mM  Solución de stock de 5-bromo-4-cloro-3-indolil- β-D-galactopiranósido (X-Gal), 50 mg/ml  Solución stock de ampicilina (100 mg/ml)  Caldo super óptimo con represión por catabólito (SOC)  Solución stock KCl (1M)  Solución de glucosa (20 %)  Solución de MgCl2 (2M) Figura 19. Clonamiento del gen catepsina CL1 en vector pGEM-T Easy. Procedimiento 1. Preparar los medios de cultivo y soluciones stock. • Medio LB líquido (1L) Triptona 10 g Extracto de levadura 5 g NaCl 5 g Agua destilada 900 ml Mezclar y ajustar a pH 7 con NaOH. Llevar a 1 litro con agua destilada. Autoclavar a 120 libras por 20 minutos. • Medio LB sólido Añadir al medio LB líquido 1.5 % de agar (v/v) y autoclavar. 36 37 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes • Medio LB sólido + ampicilina + X-gal + IPTG • Solución KCl (1M) Preparar 500 ml de medio LB solido (para 20 placas de Petri). Luego del autoclavado, dejar enfriar y añadir Disolver 7.44 g de KCl en 100 ml de agua destilada, autoclavar. 500 µI de ampicilina (100 mg/ml) (concentración final 100 µg/ml), 2.5 ml de IPTG (100 mM) (dilución final 0.5 mM) y 500 µI de X-gal (50mg/ml) (dilución final 50 µg / ml). • Solución de glucosa (20 %) En cabina de flujo laminar, verter en placas de Petri estériles. Dejar secar y almacenar a 4 °C. Disolver 100 g de glucosa en 400 ml de agua destilada. Alternativamente, añadir 100 µI de IPTG (100 mM) y 20 µI de X-gal ( 50 mg/ml) sobre las placas de LB- Ajustar el volumen a 500 ml y filtrar la solución con filtro de 0.22 µm de diámetro de poro. ampicilina, dejar que absorba durante 30 minutos a 37 °C antes de la siembra. • Solución MgCl2 (2M) • Solución de IPTG (100 mM) Disolver en 80 ml de agua bidestilada, 20.33 g de MgCl2-6H2O y 24.65 g de MgSO4-7H2O. Autocompletar hasta 100 ml, filtrar la solución con filtro de 0.22 µm de diámetro de poro. Preparar el Para una solución de 10 ml, pesar 0.24 g de IPTG, disolver en 10 ml de agua bidestilada autoclavada y mezclar. medio SOC el mismo día de la transformación. Filtrar con membrana 0.22 µm de diámetro de poro. Alicuotar 1 ml en tubos eppendorf de 1.5 mI y almacenar a -20 °C. 2. Acondicionar las células competente, emplear la cepa de Escherichia coli JM109 Promega (Figura 20), la cual se caracteriza por poseer la pared celular frágil que facilita la entrada de moléculas exógenas como ADN. • Solución de X-Gal (50 mg/ml) Pesar 0.5 g de X-Gal, disolver en 10 ml de dimetilformamida o agua destilada. No es necesario hacer la preparación cuando se adquiere la presentación en solución. Envolver en papel aluminio y almacenar a -20 °C hasta su uso. • Solución de ampicilina (100 mg/ml) Pesar 1 g de ampicilina y mezclar en 10 ml de agua bidestilada autoclavada. Filtrar la solución en filtro de 0.22 µm de diámetro de poro. Dispensar 1 ml en tubos eppendorf de 1.5 ml y almacenar a -20 °C hasta posterior uso. • Preparación de caldo súper óptimo con represión catabólica (SOC) Realizar la peparacion el mismo dia de la tranformación. Para 100 ml proceder como se describe a Figura 20. Células competentes E. coli JM109. continuación. Triptona 2 g Descongelar el stock de células competentes sobre hielo. En cabina de flujo laminar, alicuotar 50 µI de células Extracto de levadura 0.5 g competentes en tubos e inmediatamente después retornar el stock de bacterias a congelación de -80 °C, para NaCl (1M) 1 ml evitar que las bacterias sean afectadas. KCl (1M) 0.25 ml 3. Para la transformación bacteriana, centrifugar rápidamente el tubo conteniendo el producto ligado Disolver, ajustar a pH 7 y autoclavar. Antes de usar el medio, añadir por cada 100 ml de medio, 1ml de vector- Catepsina a 3 000 rpm. glucosa (2M) y 1 ml de MgCl2 (2M). 4. Descongelar las células competentes y mantenerlas sobre hielo picado por 1 hora (Figura 21A). • Medio líquido 2xYT (1L) 5. En un tubo eppendorf de 1.5 ml, adicionar 50 µI de células competentes y 3 µI del producto de la ligación Triptona 16g (vector más el inserto) e incubar en hielo picado por 20 minutos (Figura 21B). Extracto de levadura 10g NaCl 5g 6. Realizar la transfección de ADN a las células competentes mediante shock térmico. Colocar el tubo Agua destilada 900 ml eppendorf por 45 segundos en baño maría a 42 °C (Figura 21C). Inmediatamente después incubar el tubo en hielo picado por 2 minutos Mezclar y ajustar a pH 7 con NaOH. Llevar a 1 litro con agua destilada. Autoclavar por 20 minutos. 38 39 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 7. Agregar al tubo 950 µI de medio SOC e incubar a 37 °C con una agitación de 150 rpm en una incubadora- 10.10. Multiplicación de células competentes transformadas shaker (Figura 22). En la multiplicación de células transformadas de Escherinchia coli JM109, emplear el medio líquido 2xYT que 8. Luego, añadir 100 µI de células transformadas en placas de LB conteniendo X-gal, IPTG y ampicilina, tiene una formulación optimizada para el crecimiento y mantenimiento de cepas recombinantes de Escherichia sembrar con asa de siembra e incubar a 37 °C por 18 horas. coli. El medio 2xYT suministra nutrientes como el extracto de levadura y triptona que proporcionan todos los aminoácidos requeridos, precursores de nucleótidos, vitaminas y otros metabolitos como el cloruro de sodio 9. Transcurido el tiempo, aislar las colonias transformadas conteniendo el plásmido mas inserto (de color crema, necesarios para el transporte de iones de sodio y equilibrio osmótico. las colonias de color azul solo tiene el vector) (Figura 23). Luego sembrar en medio líquido 2XYT con ampicilina e incubar por 18 horas a 37 °C y 150 rpm de agitación (Figura 24). Reactivos Materiales y equipos A B C  Medio 2xYT  Tubos eppendorf de 1.5 ml  Agua destilada  Incubadora  Autoclave  Asa de siembra  Mechero  Placas bacteriológicas estériles  Guantes  Papel toalla  Marcador para rotular Figura 21. Transformación de células competentes. A) Mantener las células sobre hielo por una hora. B) Agregar el  Cámara de flujo laminar producto de la ligación. C) Aplicación de shock térmico en baño maría. Procedimiento 1. En cabina de flujo laminar, a partir del cultivo previo, sembrar con asa de siembra en medio sólido 2xYT + ampicilina e incubar en estufa a 37 °C por 18 horas. 2. Sellar las placas petri con papel cera y conservar a 4 °C hasta posterior uso. 3. Para mantener viable las colonias transformadas realizar el repique a los 30 días post siembra en medio Figura 22. Multiplicación de las células transformadas. 2xYT + ampicilina en cabina de flujo laminar e incubar a 37°C por 18 horas. Figura 23. Evaluación de las células transformadas conteniendo el inserto CL1. 40 41 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 10.11. Extracción de ADN plasmídico de bacterias transformadas 7. Descartar el flujo eluído y centrifugar nuevamente la columna vacía a 12 000 rpm por 1 minuto. 8. Transferir la columna a un nuevo tubo de colecta, previamente numerado. El objetivo del protocolo es obtener ADN plamídico libre de impurezas a partir de un cultivo de bacterias 9. Luego añadir al filtro de la columna 35 µI de agua ultrapura. transformadas. El plásmido obtenido es empleado como vector de expresión de catepsina CL1 de Fasciola hepatica y se inyecta directamente al tejido-diana donde se expresará generalmente sin integrarse en el 10. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. genoma de las células huésped, quedando protegido en el interior de la célula por elementos que permiten su replicación en cada división celular como si fuese un mini cromosoma artificial. 11. Centrifugar a 12 000 rpm por 1 minuto. Reactivos Materiales y equipos 12. Evaluar la concentración mediante espectrofotometría (Figura 25).  PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit  Tubos eppendorf 1.5 ml Thermo Scientific Scientific  Tubos eppendorf de 250 µI A B  Recipiente con hielo picado Componentes  Recipiente para descarte de líquidos - Buffer de resuspensión (R3)  Recipiente para descarte de puntas - RNasa A (20 mg / ml)  Vórtex - Buffer de lisis (L7)  Centrifuga refrigerada - Buffer de precipitación (N4)  Pipetas automáticas - Buffer de lavado (W9)  Puntas libres de ARNasa - Tubo de lavado (W10)  Guantes - Buffer TE (TE)  Papel toalla - Tubos de lavado y columnas de purificación  Marcador para rotular  Cabina de flujo laminar Procedimiento 1. A partir de un cultivo bacteriano incubado toda la noche a 37 °C. Colectar células transformadas por centrifugacion (Figura 24), a 12 000 rpm por 1 minuto. Descartar el sobrenadante. 2. Resuspender, mediante pipeteo, el pellet de células en 250 µI de buffer R3. Añadir 250 µI de buffer L7 y mezclar por inversión (se formará 2 fases). Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. 3. Añadir 350 µI de buffer N4, mezclar por inversión. En este paso se formará una solución lechosa debido a la precipitación de proteínas. Figura 24. E. coli JM 109 transformadas. (A) Cultivo bacteriano incubado toda la noche a 4. Centrifugar por 10 minutos a 12 000 rpm. 37 °C. (B) Colecta de células bacterianas en tubo eppendorf para el proceso de extracción de ADN plasmídico. 5. Luego, con la ayuda de una micropipeta, y evitando absorber el sedimento, colectar cuidadosamente el sobrenadante y transferir a una columna de purifición del kit adosado a un tubo de colecta. Centrifugar a 12 000 rpm por 1 minuto. 6. Adicionar 700 µI de buffer W9 a la columna y centrifugar a 12 000 rpm por 1 minuto. 42 43 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 10.12. Encapsulación de ADN plasmídico con polímero biodegradable – Ácido poliláctico (PLA) En el desarrollo de vacunas se ha incorporado recientemente la nanotecnología, proporcionando sistemas de administración de antígenos basados en nanotransportadores, que ofrecen la oportunidad de mejorar las respuestas inmunes celulares. La encapsulación de proteínas recombinantes en micro y nanopartículas biocompatibles y biodegradables como el ácido poliláctico (PLA) está emergiendo como una importante herramienta para aumentar la inmunidad. Así en los últimos años, en el campo de la investigación biomédica se ha observado un creciente interés en los materiales nanoestructurados para la mejor administración de vacunas. Estos polímeros son biocompatibles, lo que ha permitido que los fármacos tengan una liberación controlada; así mismo, su baja toxicidad hacen de estos unos buenos adyuvantes para la administración de vacunas, mejorando la estabilidad de los antígenos. Reactivos Materiales y equipos  ADN plasmídico  Tubo eppendorf de 1.5 ml  Ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA)  Tubos falcon de 15ml y 50 ml Figura 25. Evaluación de la concentración ADN plasmídico en espectrofotómetro.  Polímero ácido poliláctico (PLA)  Recipiente con hielo picado  Alcohol polivinílico (PVA)  Recipiente para descarte de líquidos  Buffer TRIS-EDTA (ácido  Recipiente para descarte de puntas etilendiaminotetraacético)  Vórtex  Cloroformo  Filtros estériles  Agua estéril  Sonicador  Agitador magnético  Espectrofotómetro  Pipetas automáticas  Puntas libres de ARNasa  Guantes  Papel toalla  Marcador para rotular Procedimiento 1. Preparar la solución de polímero en un tubo de 15 ml. Disolver 30 mg de PLGA en 1 ml de cloroformo. Agitar con vórtex de 30 a 60 minutos hasta su completa disolución. 2. Mezclar 1 mg de ADN plasmídico y 200 μl de buffer tris-EDTA. 3. Preparar la solución de PVA al 2 % (p / v) saturada. - Espolvorear lentamente 0.2 g de PVA en 10 ml de buffer tris-EDTA frío, mezclar con un agitador magnético aproximádamente por 30 minutos hasta su completa disolución. - Centrifugar la solución de PVA a 1 000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. 44 45 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes - Filtrar a través de un filtro estéril de 0.22 μm para eliminar cualquier partícula de PVA no disuelto en la 11. PROTOCOLO DE EVALUACIÓN PRECLÍNICA DE VACUNACIÓN solución. Luego agregar 10 μl de cloroformo para saturar la solución de PVA. (ADN recombinante de catepsina CL1 encapsulado de Fasciola hepatica) 4. En la solución de PVA, agregar la mitad de solución de DNA plasmídico y agitar en vórtex durante 1 minuto, luego adicionar la otra mitad y una vez más agitar con vortex por 1 minuto. En este paso se Para la evaluación preclínica de la vacuna seguir el protocolo experimental descrito a continuación. formará una emulsión de agua en aceite. 11.1. Diseño del protocolo experimental 5. Sonicar el tubo con la solución. Este proceso reduce el tamaño de gota de la emulsión (emulsión primaria) (Figura 26). Realizar las evaluaciones de inmunidad y de protección de la vacuna, en un modelo animal vacuno y ovino. Distribuir los dos modelos de animales en 1 grupo control y 2 grupos de tratamiento, con 3 animales cada uno. 6. Dispensar 6 ml de solución de PVA a un tubo de centrífuga de 50 ml. Agregar la emulsión primaria, en dos partes, agitar en vórtex por 1 minuto después de cada adición. Esto forma una doble emulsión de En los individuos, durante el tiempo cero (T0), tiempo 1 (T1) y tiempo2 (T2), evaluar los parámetros de agua en aceite en agua. función renal y hepática, ademas de realizar pruebas de hematología, leucograma y perfil de anticuerpos (Figura 27). 7. Sonicar la doble emulsión durante 5 minutos. Adicionalmente, determinar la carga parasitaria, desarrollo de formas adultas y viabilidad de huevos en el 8. Agitar la emulsión resultante durante la noche (18 horas) en un beacker tapado con papel aluminio. tiempo 2 (T2) post desafío experimental. Aplicar agitación magnética suave para permitir que el cloroformo se evapore. Evite la turbulencia excesiva. Recuperar por ultracentrifugación. 9. Resuspender el sedimento en 5 ml de buffer tris-EDTA, agregar sobre el sedimento el buffer tris-EDTA varias veces hasta que se suspenda por completo. Luego sonicar la suspensión durante 30 segundos 10. Repetir los pasos 7 y 8 para eliminar ADN no encapsulado y PVA. Determinar la concentración de ADN no atrapado empleando los sobrenadantes del paso 7 y 8. Cuantificar por espectrofotometría de absorbancia a una longitud de onda de 260 nm. Emplear el sobrenadante y el eluído del lavado de las nanoparticulas, pero sin ADN, para poner a cero el instrumento. 11. Resuspender el sedimento en 1-2 ml de agua estéril y someter a ultrasonido la suspensión durante 1 minuto. Figura 27. Esquema del diseño experimental empleado en evaluación de vacunos y ovinos sometidos a diferentes protocolos de vacunación. Figura 26. Sonicación de antígeno para encapsulamiento. 46 47 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes Modelo animal-ovino 11.2. Desafío experimental (i) Grupo control (C). Realizar el desafío experimental con metacercarias de Fasciola hepatica, obtenidos de hospederos Aplicar a los animales una dosis de 1 ml de solución salina estéril 0.9 %, vía intramuscular. intermediarios (Galba truncatula) criados en el laboratorio e infectados con miracidium. Inocular la fase infectante del parasito vía oral utilizando cápsulas de gelatina (Figura 29). (ii) Grupo ADN plasmídico (DNAp) encapsulado en PLA + saponina. Aplicar a los animales, por via intramuscular, una dosis de 150 µg de ADN plasmídico encapsulado en Realizar el desafío experimental, 15 dias después de la última dosis de la vacuna, con 150 metacercarias de ácido poliláctico (PLA) con 300 μl de saponina como adyuvante. Fasciola hepatica en el modelo ovino y 300 metacercarias en modelo vacuno. (iii) Grupo DNAp encapsulado en ácido poliláctico (PLA) + adyuvante de Freund. Aplicar a los animales, por vía intramuscular, una dosis de 150 µg de DNA plasmidico encapsulado en ácido poliláctico (PLA) con 300 μl de adyuvante de Freund. Modelo animal-vacuno (i) Grupo Control (C). Aplicar a los animales una dosis de 1 ml de solución salina estéril 0.9 %, vía intramuscular. (ii) Grupo DNAp encapsulado en PLA + saponina . Aplicar a los animales una dosis de 300 µg de DNA plasmídico encapsulado en ácido poliláctico (PLA) con 300 μl de saponina como adyuvante, por vía intramuscular. (iii) Grupo DNAp encapsulado en PLA + adyuvante de Freund. Figura 29. Infección de carneros con metacercarías. Aplicar a los animales una dosis de 300 µg de DNA plasmidial encapsulado en ácido poliláctico (PLA) con 300 μl de adyuvante de Freund, por vía intramuscular. Colectar la sangre de los animales vía yugular en el tiempo T0 (inmediatamente antes da primera dosis), T1 (después de 15 días de la tercera dosis) y T2 (10 semanas después del desafío experimental e inmediatamente Aplicar en ambos modelos de animal, tres dosis vía intramuscular utilizando una aguja hipodérmica N° después de la eutanasia) (Figura 30). En las muestras colectadas realizar el análisis de función hepática y renal, hemograma y niveles de IgG. 16 (16G / 1.5 “), con un intervalo de tiempo entre dosis de 15 días (Figura 28). Figura 28. Inmunización de vacunos. Figura 30. Toma de muestra de sangre para análisis preclínico. 48 49 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes Luego del desafío experimental y después de la eutanasia de los animales, colectar los hígados para análisis 11.5. Evaluación de parámetros hematológicos del desarrollo de formas adultas y viabilidad de huevos de Fasciola hepatica. Realizar el análisis de carga parasitaria, 6 semanas después del desafío experimental por la técnica de sedimentación modificada de Evaluar los parámetros hematológicos del modelo vacuno y ovino en los diferentes tiempos T0, T1 y T2. Denis (Figura 31) Colectar la sangre del modelo animal, por punción de la vena yugular, en un tubo de 10 ml conteniendo 10 µl del anticoagulante heparina (5 000 UI/ml). En el hemograma determinar leucocitos totales, hematíes, plaquetas y concentración de hemoglobina. 11.6. Evaluación del perfil humoral Para el análisis de los niveles de IgG total anti-catepsina, evaluar en los diferentes grupos experimentales, la presencia de anticuerpos contra catepsina de Fasciola hepatica a través del ensayo de ELISA indirecto en los tiempos T0 y T2 (Moreira et al., 2002) Los resultados de los niveles de IgG están representadas por la media de los valores de densidad óptica (DO) ± 2 desviaciones estándar de las lecturas de las muestras de los sueros control no infectados. Figura 31. Evaluación de desarrollo de formas adultas de Fasciola hepatica post desafío. 11.3. Evaluación de los aspectos relacionados a inocuidad y toxicidad de vacuna Observar la zona de inóculo y el comportamiento de los animales durante el día de la inmunización y días subsiguientes. En la zona de inoculación observar macroscópicamente la formación de lesiones, presencia de nódulos, pápulas y lesiones ulcerativas. Es importante también observar el comportamiento de los animales ya que pueden presentar erizamiento de pelo, agresividad y apatía. Realizar el monitoreo durante los 135 días que comprende el periodo, desde las inmunizaciones hasta la eutanasia (75 días después del desafío experimental). 11.4. Análisis de la función hepática y renal Para el estudio de función hepática evaluar el dosaje de enzimas alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST). Determinar los niveles de urea y creatinina para el análisis de la función renal. Evaluar las funciones tanto hepática como renal mediante el método UV enzimático. 50 51 Manual de protocolos de laboratorio en la elaboración de vacunas /// Instituto Nacional de Innovación Agraria para el control inmunológico de Fasciola hepatica en rumiantes 12. REFERENCIAS Fairweather, I., & Boray, J. (1999). Fasciolicides: efficacy, actions, resistance and its management. Vet J 158: 81-112. Acha, P., y Szyfres B. (2003). 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