Scientia Agropecuaria 12(4): 517-524 (2021) Peña et al. SCIENTIA AGROPECUARIA Facultad de Ciencias Scientia Agro pecuaria Agropecuarias Universidad Nacional de Web page: http://revistas.unitru.edu.pe/index.php/scientiaagrop Trujillo RESEARCH ARTICLE Genetic diversity and phylogeny of the genus Cinchona in Cutervo National Park, Peru Diversidad genética y filogenia del género Cinchona en el Parque Nacional de Cutervo, Perú Karla Andrea Peña Yacila1, * ; Erick Antonio Suarez-Peña2 ; Carlos Alberto Torres Pera3 ; Luis Alberto Bermejo Requena1 ; Luis Xavier Llacsa Sánchez4 ; Iris Zárate Rodríguez5; Oscar Junior Paredes-Vilca6 ; José Yasser Dávila García6 1 Universidad Nacional de Tumbes, Laboratorio Microbiología, Av. Universitaria S/N Pampa Grande – Tumbes. Peru. 2 Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA), Estación Experimental Agraria Los Cedros, km 12-Panamericana Norte-Caserío los Cedro, Tumbes. Peru. 3 Universidad Nacional Mayor de San marcos, Facultad de Ciencias Biológicas, Av. Carlos Germán Amézaga 375 - Edificio Jorge Basadre, Ciudad Universitaria, Lima. Peru. 4 Inca’Biotec SAC- Perú, departamento de Sanidad Vegetal, Jr. Filipinas 212, Tumbes, Peru. 5 Servicio Nacional de Áreas Naturales Protegidas por el Estado-SERNANP, Av. San Juan 724, Cutervo-Cajamarca. Peru. 6 Universidad Nacional Agraria La Molina-UNALM, Av. La Molina s/n, La Molina. Peru. * Corresponding author: k.p.yacila@gmail.com (K. A. Peña Yacila). Received: 13 July 2021. Accepted: 18 November 2021. Published: 15 December 2021. Abstract Species of the genus Cinchona are recognized for their effectiveness in treating malaria. For Peru, this genus is of greater importance regarding forestry and civic aspects, because it represents the richness of the plant resource. Nevertheless, nowadays Cinchona populations are strongly threatened by various anthropogenic activities. Cutervo National Park (PNC) is the Peruvian's first Protected Natural Area (ANP) and is considered as a conservation unit for the genus Cinchona. Objective: Determine the genetic diversity and phylogenetic relationships of the species of the genus Cinchona that inhabit the PNC. Methods: We tested 13 samples using the matK marker and a phylogenetic tree was generated using the maximum likelihood method and bootstrap measures of phylogenetic support. Results: 8 number of haplotypes (h) were recorded, with haplotype diversity (Hd) 0.859 and nucleotide diversity (π) 0.35%, also identifying: C. calisaya, C. pubescens and C. pitayensis for the PNC; the phylogenetic tree showed C. pitayensis as conserved specie, meanwhile C. pubsecens is present in many groups. Conclusions: The high genetic diversity of Cinchona and haplotype record of C. calisaya, species with a national conservation category of "Vulnerable", increases the importance for biodiversity conservation of the PNC. Keywords: Conservation; Cinchona tree; haplotype diversity; nucleotide diversity; matK marker. Resumen Las especies del género Cinchona son reconocidas mundialmente por su eficacia en el tratamiento contra la malaria. Para el Perú, este género reviste mayor importancia a los aspectos forestal y cívico, por representar la riqueza del recurso vegetal. Sin embargo, en la actualidad sus poblaciones se encuentran fuertemente amenazadas por diversas actividades antropogénicas. El Parque Nacional de Cutervo (PNC) es la primer Área Natural Protegida (ANP) del Perú y es considerado como unidad de conservación para el género Cinchona. Objetivo: Determinar la diversidad genética y las relaciones filogenéticas de las especies del género Cinchona presentes en el PNC. Métodos: Nosotros evaluamos 13 muestras empleando el marcador matK y se generó un árbol filogenético empleando el método de máxima verosimilitud con soporte de filogenia bootstrap. Resultados: 8 haplotipos fueron registrados, con una diversidad haplotípica (Hd) 0.859 y nucleotídica (π) 0.35 %, identificándose además a: C. calisaya, C. pubescens y C. pitayensis para el PNC; el árbol filogenético mostró que la especie C. pitayensis se encuentra bastante conservada, mientras que C. pubsecens se encuentra presente en distintos grupos con similitud variable. Conclusiones: La elevada diversidad genética de Cinchona y el registro del haplotipo de C. calisaya, especie con categoría de conservación nacional “Vulnerable”, incrementa la importancia para la conservación de la biodiversidad del PNC. Palabras clave: Conservación; Árbol de la quina; diversidad haplotípica; diversidad nucleotídica; marcador matK. DOI: https://dx.doi.org/10.17268/sci.agropecu.2021.056 Cite this article: Peña Yacila, K. A., Suarez-Peña, E. A., Torres Pera, C. A., Bermejo Requena, L. A., Llacsa Sánchez, L. X., Zárate Rodríguez, I., Paredes- Vilca, O. J., & Dávila García, J. Y. (2021). Diversidad genética y filogenia del género Cinchona en el Parque Nacional de Cutervo, Perú. Scientia Agropecuaria, 12(4), 517-524. -517- Scientia Agropecuaria 12(4): 517-524 (2021) Peña et al. 1. Introducción poblaciones se encuentran fuertemente amenazadas por La biodiversidad se comprende en diferentes niveles (la actividades, como la sobre explotación del recurso, variedad de ecosistemas, especies y genes) y la compleji- deforestación y degradación del hábitat por crecimiento dad de sus interacciones conforma el sistema de soporte urbano (Huamán et al., 2019; López, 2016; Mendoza, de la vida (De Andrade, 2013; Rawat & Agarwal, 2015), sus Ramírez, & Jiménez, 2014). muchos beneficios han sido confirmados en múltiples es- A nivel internacional diversos estudios moleculares en el tudios y aún en la actualidad continúan revelándose, lle- género Cinchona y taxones relacionados emplearon el gando incluso a proponerse a la biodiversidad como con- marcador matK, obteniendo información representativa trolador en la manifestación de enfermedades emergen- en sistemática y filogenia (Andersson & Antonelli, 2005; tes por zoonosis (Ezenwa et al., 2006; Johnson & Chilquillo, 2016; Maldonado et al., 2017). En contraparte, Thieltges, 2010; Keesing et al., 2010). para el Perú, si bien los datos biológicos existentes sobre No obstante, a pesar de todos sus beneficios, se registra el género Cinchona registran aspectos históricos, taxonó- una alarmante pérdida de la biodiversidad, ligado a un micos, farmacológicos y ecológicos (Albán, 2013; Huamán marcado efecto antropogénico sobre todos los niveles de et al., 2019; Nair, 2010; Zevallos, 1989), se carece de estu- variación biológica (Hoffmann et al., 2010), reportándose dios moleculares para este género y del conocimiento de tasas de extinción entre 100 y 1000 veces superiores a las su historia evolutiva, datos fundamentales para el correcto tasas de los cincos episodios de extinción masiva anterio- establecimiento de actividades de restauración sin res a la aparición del ser humano (Pimm et al., 1995). En perjuicio de la diversidad local (Albán-Castillo et al., 2020). este contexto, es una prioridad global acelerar la descrip- El PNC, establecido el 20 de setiembre de 1961, es la pri- ción de la biodiversidad y gestionar su conservación mer ANP de esta categoría en el Perú y se enfoca en la (Marchese, 2015; Martins et al., 2020). conservación del ave “guácharo” Steatornis caripensis y La diversidad de especies y ecosistemas deriva de proce- ecosistemas de tipo páramo, bosque seco y bosque hú- sos evolutivos a nivel genético, por ello, esta es la base de medo (SERNANP, 2014; SERNANP 2017). Adicionalmente, la biodiversidad y un requisito primordial para la evolución es considerado una de las cuatro unidades de conserva- (Collada & Jiménez, 2008; Piñero, 2008). Si la diversidad ción para el género Cinchona en el Perú (Zevallos, 1989), genética de una población se reduce, indefectiblemente pese a ello, hasta la actualidad se carece de investigacio- disminuye su capacidad de adaptarse ante potenciales nes para este género en el PNC. Por consiguiente, el cambios ambientales, por lo que, mantener la variabilidad objetivo del presente estudio fue determinar la diversidad genética es vital para responder exitosamente a las pre- genética y las relaciones filogenéticas de las especies del siones ambientales de selección. género Cinchona que habitan en el PNC, con la finalidad El estudio de la diversidad genética se basa en el análisis de generar información que permita la conservación de de potentes marcadores moleculares de naturaleza pro- este recurso. teica y de ADN (nuclear y citoplasmático), en particular para el grupo de las plantas, los marcadores del cloro- 2. Materiales y métodos plasto (ADN cp), destacan en la investigación de la historia Área de estudio y recolección de la muestra: Corresponde de las poblaciones, flujo genético, hibridación e identifica- al PNC, el cual se encuentra localizado en el área deno- ción de áreas con elevada diversidad genética (Caruso et minada Cordillera de Tarros (2200-3500 m.s.n.m.), se al., 2015; Collada & Jiménez, 2008; Salvador et al., 2000). ubica en los andes del norte del Perú, protegiendo bos- El grupo de trabajo de plantas del “Consortium for the ques montanos, páramos, y principalmente los bosques Barcode of Life” (CBOL), recomienda el uso de los genes de neblina de las nacientes más altas de la cuenca del cloroplastidícos matK + rbcL, para desarrollar códigos de Marañón en la Región Cajamarca. barras (Little, 2014), también se ha reportado que el El material botánico fue colectado durante los meses de marcador matK tiene una tasa evolutiva rápida y provee febrero a marzo del 2016, en siete centros poblados una alta señal de filogenia para resolver la sistemática en (Figura. 1), distribuidos en los distritos de: San Andrés de plantas (Hilu & Liang, 1997). Cutervo, Santo Tomás, Santo Domingo de la Capilla, ubi- El género Cinchona está representado por 24 especies cados en el departamento de Cajamarca, Perú (Tabla 1). botánicas, comúnmente conocidas como “quina” o “cas- La identificación preliminar en campo de los individuos del carilla”, de importancia en el tratamiento contra la malaria género Cinchona, se basó en caracteres morfológicos, si- por su composición de alcaloides de quinina en la corteza guiendo las claves establecidas Zeballos (1989) y biblio- (Aymard, 2019; Cueva-Agila et al., 2019; Zevallos, 1989; grafía científica especializada (Aymard, 2019; Gómez, Nair, 2010). Las especies de este género, usualmente, ha- Beraun, Gómez, & Llatas, 2016; Killeen, García & Beck, bitan en los bosques de montaña de los sectores central 1993; Mostacero, Mejía & Gamarra, 2009). Con la finalidad y noreste de cordillera andina (Antonelli et al., 2009; de evaluar hojas sanas, se colectaron dos muestras de ho- Aymard, 2019). jas maduras por individuo, extraídas de la parte superior El Perú registra 18 de las 24 especies reconocidas, siendo de la planta, a una altura aproximada de 2,5m, solo se el país con mayor cantidad de especies para el género procesó una hoja por individuo, la segunda hoja fue al- Cinchona (Albán, 2013; Aymard, 2019; Huamán, Albán, & macenada como material de respaldo. Durante la colecta Chilquillo, 2019). Este género reviste importancia para el se registraron las coordenadas geográficas, el material país, más allá de los niveles forestal y cívico, por biológico fue rotulado y transportado en bolsas representar la riqueza del recurso vegetal (Huamán et al., herméticas estériles al laboratorio de la empresa 2019; Zevallos, 1989). A pesar de esto, actualmente sus Inca´Biotec SAC para su posterior procesamiento. -518- Scientia Agropecuaria 12(4): 517-524 (2021) Peña et al. Tabla 1 Coordenadas de muestreo en el Parque Nacional Cutervo, Cajamarca-Perú Código de Altitud Centro Poblado Este (X) Norte (Y) la muestra (m.s.n.m.) 1 Tarros (TR) 741883.00 9304831.00 2308.00 8 La Flor (LF1) 745508.00 9317600.00 2138.00 11 La Flor (LF2) 745505.00 9317605.00 2142.00 12 La Granadilla (LG1) 745508.00 9317605.00 2141.00 Zona de Amortiguamiento (Puente El Suro-límite entre el distrito de San 14 749914.00 9319693.00 2498.00 Andrés de Cutervo y Santo Tomás) (ZA) 15 La Granadilla (LG2) 749433.00 9319636.00 2405.00 17 Playa Grande (PG1) 748665.00 9314309.00 2411.00 18 Playa Grande (PG2) 750428.00 9314864.00 2393.00 21 Las Grutas (LGR1) 749795.00 9315125.00 2318.00 23 Las Grutas (LGR2) 748514.00 9311518.00 2682.00 25 Las Grutas (LGR3) 748202.00 9311092.00 2771.00 30 El Suro (ES1) 747514.00 9312366.00 2850.00 32 El Suro (ES2) 747511.00 9312365.00 2850.00 Datum WGS84, Zona 17S. Figura 1. Localización de los puntos de muestreo. -519- Scientia Agropecuaria 12(4): 517-524 (2021) Peña et al. Extracción de ADN cloroplastidial (ADN cp): Se realizó la para lo cual se emplearon los siguientes volúmenes de extracción de ADN cp, siguiendo el protocolo establecido rección: 2,50µl Buffer Premix 10X, 0,50 µL de dNTPs por Doyle & Doyle (1987), adaptado para el género (10mM), 0,50 µL de BSA (100X), Taq Polimerasa (0,5 U / μl) Cinchona, mediante ensayos preliminares en el 0,10 µL, Primer Reverse matK3B (15 pMol / μl) 0,60 µL, laboratorio. La superficie de las hojas fue desinfectada con Primer Forward matK2A (15 pMol / μl) 0,60 µL, agua ultra alcohol al 70%, consecutivamente, se extrajo un corte de pura 18,20 µL, ADN 2,00 µL. Los ciclos térmicos para la 2 cm2, evitando las nervaduras. Las muestras fueron amplificación consistieron en una desnaturalización inicial trituradas en un mortero, con nitrógeno líquido, a 94 °C por 5 min, seguido por 34 ciclos compuestos por transfiriéndose 0,1g del triturado a un microtubo, en el una desnaturalización 94 °C por 30 segundos, hibridación cual se agregaron 590 µl del buffer de extracción Bromuro a 49 °C por 45 s; extensión 72 °C por 45seg, concluyendo de Cetiltrimetilamonio (CTAB 2X) previamente calentado con una extensión final a 72 °C durante 6min. a 60 °C, y 10 µl de b-Mercaptoetanol. Seguidamente, la mezcla fue homogeneizada en Vortex (GB Lab®) durante Validación de extracción de material genético: La 1 minuto, mantenida a una temperatura de 60°C por 60 validación de la extracción de ADN se llevó a cabo minutos (uniformizando cada 15minutos), luego se mediante la migración del ADN genómico en un gel de adicionaron 300 µl de fenol concentrado y 300 µl de agarosa al 1%, agregándose 0,5 g de agarosa y 50 ml de Cloroformo/Alcohol isoamílico (24:1). TAE 1X; mientras que para los productos de los genes La mezcla fue homogeneizada y centrifugada a 12 mil rpm actiplant y matK se migraron geles de agarosa al 1,5%, por 10min a 4 °C, posteriormente se transfirió el agregándose 0,9 g de agarosa y 60 ml de TAE 1X. Ambos sobrenadante a un nuevo microtubo, evitando tomar la productos emplearon Blue/Orange Loading Dye 6X como interfaz, y se adicionó un volumen igual de Cloroformo tampón de depósito a una relación 5 : 1 μl por cada /Alcohol Isoamílico (24:1), para ser centrifugada muestra. La migración del ADN se llevó a 90V por 15 min, secuencialmente a 13 mil rpm durante 10 min a 4 °C y a colocando posteriormente el gel de agarosa en el 12 mil rpm por 10 minutos a 4 °C, recuperándose el transiluminador UV. sobrenadante a un nuevo microtubo. Rápidamente, se agregó Isopropanol helado (6/10) y se incubó a -20 °C por Secuenciamiento y análisis filogenético: Los productos de un lapso de 30-60 minutos. Se centrifugó la PCR fueron preparados para posteriormente ser secuencialmente la muestra a 10 mil rpm a 4 °C por 10 y 5 enviados a secuenciar a MACROGEN®. Las secuencias minutos, eliminando el sobrenadante y agregando 500 µl fueron editadas y alineadas con el algoritmo del software de etanol al 75% después del primer centrifugado, MAFFT (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/), en el posteriormente se eliminó el sobrenadante. software Mr Bayes 3,2 (Ronquist et al., 2012). Para la Finalmente, el pellet se dejó secar a temperatura identificación de especies se consideró un límite máximo ambiente, se suspendió en 50µl de T.E (Tris HCL 10mM y de divergencia genética de 1%. EDTA 1Mm pH 8.0) y se agregó 1 µl de RNasa (10 mg/ml) Las secuencias del gen matK obtenidas por PCR fueron e incubó a 37 °C por 30 minutos, el ADN se conservó a - comparadas con las secuencias disponibles en la base de 20 °C. La cuantificación del ADN se realizó por datos del GenBank usando el Basic Local Alignment espectrofotometría, con un volumen total de 60 μl de la Search Tool (BLAST) de la National Center for muestra y una dilución de 5 μl ADN + 55 μl buffer TE pH: Biotechnology Information (NCBI) 8. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) El análisis filogenético se efectúo empleando el método Amplificación del gen actiplant: Se amplificó la región de máxima verosimilitud (ML), la prueba de Filogenia específica del gen de actina del ADNcp mediante PCR, Bootstrap se efectuó con 1000 repeticiones. La raíz del del empleándose los siguientes primers: Forward (5’-CAC filograma se infirió empleando el haplotipo generado de TAC TAC TGC TAA ACG GG AAA-3’) y Reverse (5’-ACA la secuencia del gen matK para la especie Remijia TCT GCT GGA AGG TGC TG-3’); y los volúmenes de pedunculata como grupo de referencia. reacción: 2,5 µL de Buffer Premix 10X, 0,5 µL de dNTP’s, 1 El análisis diversidad genética se realizó mediante el µL de MgCl₂ a 25 mM, 1 µL de Primer ACTplant F, 1 µL de polimorfismo de secuencias de ADN (DnaSP), evaluando Primer ACTplant R, 0,2µL de Taq DNA Polymerase como indicadores el número de haplotipos (h), la (PlatinumR), 16,8µL de agua libre de nucleasas y 2 µL de diversidad haplotípica (Hd) y la diversidad nucleotídica (π), ADNcp. Los ciclos térmicos para la amplificación los valores de los indicadores se calcularon con el software consistieron en una desnaturalización inicial a 95 °C por 5 DnaSP (Librado & Rozas, 2009). minutos, seguido por 35 ciclos compuestos por una desnaturalización a 95 °C por 5 segundos, hibridación a 3. Resultados y discusión 54 °C por 45 segundos, elongación a 72 °C por 45 segundos, concluyendo con una extensión final a 72 °C Identificación de secuencias mediante el gen matK: Por por 6 minutos. medio del gen matK en la base de datos del GenBanK, se logró identificar 4 especies con una alta similitud: C. Amplificación del gen matK: La amplificación de la región pitayensi, C. pubescens, C. calisaya y Remijia pedunculata del gen matK del ADNcp se realizó con los primers (99%), con un índice de cobertura (Query Cover) Forward (5’-CCT TCG ATA CTG GGT RAA AGA T-3’) Y promedio de 100%, corroborando una identificación Reverse (5’-CGT ACA GTA YTY TTG TGT TTA CGA-3’), precisa para todos los individuos (Tabla 2). -520- Scientia Agropecuaria 12(4): 517-524 (2021) Peña et al. Tabla 2 Diversidad genética de especies del género Cinchona mediante el gen matK (En todos los casos se registró un índice de cobertura del 100% y similitud al 99%) Código de Centro poblado Identificación más cercana Max puntuación Código de Acceso Muestra TR 1 Cinchona pitayensis 375 AY538382.1 LF1 8 Cinchona pitayensis 713 AY538382.1 LF2 11 Cinchona pitayensis 791 AY538382.1 LG1 12 Cinchona pubescens 747 LN680344.1 ZA 14 Cinchona pubescens 780 LN680344.1 LG2 15 Remijiia pedunculata 616 AY538417.1 PG1 17 Cinchona calisaya 675 AY538379.1 PG2 18 Cinchona calisaya 700 AY538379.1 LGR1 21 Cinchona pubescens 675 LN680344.1 LGR2 23 Cinchona pubescens 647 LN680344.1 LGR3 25 Cinchona pubescens 708 LN680344.1 ES1 30 Cinchona pubescens 750 LN680344.1 ES2 32 Cinchona pubescens 798 LN680344.1 Descripción de centros poblados: Tarros (TR); La Flor (LF1); identificó en tres muestras de un mismo haplotipo para La Flor (LF2); La Granadilla (LG1); Zona de los centros poblados de Tarros y La Flor; de manera Amortiguamiento (Puente El Suro-límite entre el distrito resaltante, la especie C. pubescens se identificó en siete de San Andrés de Cutervo y Santo Tomás) (ZA); La; muestras para todos los centros poblados con excepción Granadilla (LG2); Playa Grande (PG1); Playa Grande (PG2); de Tarro, La Flor y Playa Grande, sin embargo, se agrupó Las Grutas (LGR1); Las Grutas (LGR2); Las Grutas (LGR3); El en cinco haplotipos, siendo las secuencias de las muestras Suro (ES1) y El Suro (ES2). del centro poblado El Suro (30 y 32) compartidas con el haplotipo de C. pitayensis. Análisis filogenético: El árbol filogenético muestra que las Para el PNC se logró identificar a la especie R. pedunculata muestras identificadas como C. pitayensis se agrupan en y tres especies del género Cinchona: C. calisaya, C. un solo clado con un elevado valor de soporte de pubescens y C. pitayensis; representando bootstrap (<98%); por otra parte, destaca que las mues- aproximadamente el 17% de la riqueza de especies tras identificadas como C. pubescens se agrupan en dis- reconocidas para el género Cinchona en el Perú, la cual tintas ramas, algunas muestras de C. pubescens se agru- asciende a 18 especies (Albán, 2013; Aymard, 2019; pan en un solo clado con un valor elevado de soporte de Huamán et al., 2019). De acuerdo con el Plan Maestro del Bootstrap (100% y 90%), sin embargo, son disimiles entre PNC y publicaciones científicas referentes, se reconoce grupos. Finalmente, otro gran grupo conformado por C. para esta ANP la presencia de C. humboldtiana, C. offinalis pubescens, C. calisaya y R. pedunculata se encuentran y C. pubescens (Sánchez & Calderón, 2010; SERNANP, agrupados (bootstrap 79), mientras que C. calisaya, se 2014), por lo que nuestros resultados representan el encuentra en una politomía sin resolver (Figura 2). primer registro de las especies C. pitayensis y C. calisaya para el PNC. Distribución de sitios polimórficos: Se registraron 45 sitios Nuestros resultados muestran conflicto con la idea polimórficos para el grupo de secuencias, descritas como: ampliamente extendida de que R. pedunculata es la 56, 59, 114, 122, 123, 180, 183, 199, 205, 216, 44, 45, 47, 58, especie hermana del clado monofilético conformado por 112, 123, 180, 183 ,199, 205, 216, 55, 124, 158, 182, 46, 138, el género Cinchona (Andersson & Antonelli, 2005; 140, 152, 154, 156, 159, 160, 179, 200, 201, 210, 211, 212, 213, Andersson, 1995; Aymard, 2019; Chilquillo, 2016). Cabe 214, 215, 217, 218, 219, 110, 153, 204. mencionar que la presencia de caracteres mixto entre Análisis de diversidad genética: Entre los 13 organismos Ladenbergia y Cinchona, determinó la reclasificación de analizados se registró un total de 8 haplotipos (h), estando Remijia pedunculata dentro del nuevo género Ciliosemina el primer haplotipo conformado por las muestras 1, 8, 11, (Andersson & Antonelli, 2005; Aymard, 2019; Chilquillo, 30 y 32; el segundo haplotipo, por las muestras 17 y 18; 2016; Manns & Bremer, 2010). mientras que el resto de los haplotipos son correspondientes de manera individual a las muestras 12, Tabla 3 14, 15, 21, 23 y 25 (Tabla 3); finalmente se comprobó que Distribución de haplotipos identificadas con el marcador matK los resultados muestran un alto nivel de diversidad Centro Haplotipos Muestra Individuos haplotípica (Hd = 0,859) y nucleotídica (π = 0,35 %) para Poblado las poblaciones de las especies del género Cinchona 1 1-8-11-30-32 5 TR, LF1, LF2, dentro del PNC. ES1, ES2 2 12 1 LG1 3 14 1 ZA El centro poblado de Las Grutas (LG) registró la mayor 4 15 1 LG2 cantidad de haplotipos por localidad, correspondiente a 5 17-18 2 PG1, PG2 la especie C. pubescens, por otra parte, el centro poblado 6 21 1 LGR1 de Playa Grande registro el único haplotipo de la especie 7 23 1 LGR2 C. calisaya con dos muestras analizadas; C. pitayensis se 8 25 1 LGR3 -521- Scientia Agropecuaria 12(4): 517-524 (2021) Peña et al. Figura 2. Árbol filogenético obtenido por Máxima verosimilitud de individuos del género Cinchona del PNC (haplotipos citoplasmáticos del gen matK). Los números en los nodos representan el valor de soporte de Bootstrap. Grupo hermano (“outgroup”): Remijia pendunculata. El árbol filogenético reporta que las muestras identificadas de Cinchona puede ser atribuida a gradientes como C. pitayensis se agrupan en un solo clado con un ambientales, así como a eventos de hibridación o elevado valor de soporte de bootstrap (<98%); por otra duplicación de sus genomas. parte, destaca que las muestras identificadas como C. La diversidad haplotípica (Hd = 0859) y nucleotídica (π pubescens se agrupan en distintas ramas, algunas de estas =0,35%) del género Cinchona en el PNC es elevada muestras se agrupan en un solo clado con un valor respecto del área del PNC (8,214.23 hectáreas) (SERNANP, elevado de soporte de bootstrap (100% y 90%), sin 2017). Se conoce que la diversidad genética está afectada embargo, estas mismas son disimiles entre grupos. por eventos demográficos históricos y contemporáneos Finalmente, otro gran grupo conformado por C. que pueden ser atribuibles a un contacto secundario entre pubescens, C. calisaya y R. pedunculata se encuentran linajes alopátricos previamente diferenciados, o bien a vinculados (bootstrap 79%), mientras que C. calisaya se una gran población estable con una larga historia encuentra en una politomía sin resolver (Figura 2). evolutiva (Grant & Bowen, 1998). A nivel local, la La robusta agrupación de C. pitayensis demuestra que distribución de la diversidad genética registró al centro esta especie se encuentra conservada en el PNC. Por otra poblado de “Las Grutas” con la mayor cantidad de parte, la distribución de C. pubescens en diversos clados haplotipos (C. pubescens) y a “Playa Grande” con un único independientes y en conjunto con C. calisaya y R. haplotipo (C. calisaya); mientras que la especie C. pedunculata, indican que esta especie tendría variedades pitayensis con un único haplotipo se registró en los hibridando con otras especies en determinadas zonas y centros poblados de “Tarros” y “La Flor” y C. pubescens conservadas en otras. del centro poblado “El Suro” (30 y 32), esto se relacionaría Patrones similares a los reportados en el presente estudio con el comportamiento diferencial de las poblaciones, fueron reportados en el árbol filogenético de la tribu debido a factores actuales como la agricultura y ganadería Cinchoneae, generado través del método de máxima local; y factores históricos como la formación de la parsimonia empleando cinco marcadores (región ITS, gen geografía presente. matK, gen rbcL, intrón rps16 y la región trnL-F) (Andersson Los resultados aquí expuestos respaldan la hipótesis de & Antonelli, 2005); y para el árbol filogenético generado que la distribución biogeográfica de C. calisaya, al sur del para Cinchoneae e Isertieae a través del método de Perú y en Bolivia, con un reciente registro puntual de inferencia bayesiana empleando siete marcadores (ITS1, ampliación hacia el norte, representaría un caso de ITS2, la región espaciadora atpB-rbcL, ndhF, rbcL, el intrón vicarianza respecto de la especie C. pubescens (bootstrap rps 16 y la región trn-T-L-F) (Manns & Bremer, 2010); esto 79%), de amplia distribución, tal como lo propusieron a pesar de que el uso de diferentes marcadores Andersson & Antonelli (2005). No obstante, para moleculares y métodos de evaluación pueden generar respaldar esta hipótesis se recomienda complementar los diferentes valores de diversidad. estudios con el uso de más marcadores moleculares. El registro de una mayor cantidad de haplotipos de C. Con respecto a C. calisaya, la cual se encuentra en pubescens sería un indicador de la presencia de categoría de conservación “Vulnerable” para la legislación variedades originadas por la presión ambiental, la cual nacional (MINAGRI, 2006) y representa endemismo para ocasiona el desarrollo de caracteres adaptativos con el Perú y Bolivia, esta es reconocida como la especie con tendencia a la especiación (García, 2012). Lo anterior mayor cantidad de alcaloides (Nair, 2010), mientras que, mencionado sería correspondiente con lo manifestado recientes investigaciones indican que su composición de por Albán-Castillo et al. (2020), quienes mencionan que la alcaloides anti malaria a nivel local estaría siendo dirigida alta plasticidad morfológica presente en varias especies por su filogenia (Maldonado et al., 2017). En consecuencia, -522- Scientia Agropecuaria 12(4): 517-524 (2021) Peña et al. el haplotipo de C. calisaya descrito para el PNC podría ser Exactas, Físicas y Naturales, 234-241. una variante particular de su diversidad genética, por lo Caruso, G., Broglia, V., & Pocovi, M. (2015). Diversidad genética. que continuar con estudios en esta especie es Importancia y aplicaciones en el mejoramiento vegetal. Publicación del Instituto de Ecología y Ambiente Humano, 4(1), preponderante. 45-50. Chilquillo, E. A. (2016). Filogenia do gênero Ladenbergia Klotzsch 4. Conclusiones (Rubiaceae: Cinchoneae) e taxonomia atualizada das espécies que ocorrem nos Andes tropicais. Mestre em Mediante este estudio, se incrementó el número de Biologia Vegeta, Instituto de Biologia da Universidade especies del género Cinchona en el PNC con la Estadual de Campinas. Brasil. identificación molecular de C. calisaya, C. pubescens y C. Collada, C., & Jiménez, P. (2008). Técnicas para la evaluación de la pitayensis, asimismo se confirmó la presencia de R. diversidad genética y su uso en los programas de pedunculata. La resolución de la topología del árbol conservación. Forest Systems, 9(4), 237-248. DOI: 10.5424/706. filogenético confirma que C. pitayensis se encuentra Cueva-Agila, A., Vélez-Mora, D., Arias, D., Curto, M., Meimberg, conservada dentro del PNC, mientras que la identificación H., & Brinegar, C. (2019). Genetic characterization of de 7 haplotipos distribuidas en tres grupos de Cinchona fragmented populations of Cinchona officinalis L. demuestra la elevada diversidad genética presente en el (Rubiaceae), a threatened tree of the northern Andean cloud PNC. 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(2006). especies y comprender su distribución, además de Avian diversity and West Nile virus: Testing associations concientizar a la población sobre la importancia en la between biodiversity and infectious disease risk. Proceedings conservación y expansión de esta especie amenazada. of the Royal Society B: Biological Sciences, 273(1582), 109-117. García, E. C. (2012). Mecanismos de especiación ecológica en plantas y animales. Biológicas Revista de la DES Ciencias Agradecimientos Biológico Agropecuarias, 14(2), 7-13. Nuestro especial agradecimiento al equipo técnico de la empresa Gómez, A., Beraun, L. A., Gómez, O. J., & Llatas, E. (2016). Procesos de investigación y servicios Inca’Biotec SAC- Perú y al personal del de regeneración natural de la quina o cascarilla (Cinchona Parque Nacional de Cutervo por las facilidades brindadas en la spp.) en los bosques de neblina del distrito de Kañaris, region ejecución del presente estudio. Lambayeque. 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